Ett detaljerat protokoll för generering av självmonterade humana proteinmikromatriser för screening av kinashämmare presenteras.
Screening av kinashämmare är avgörande för att bättre förstå egenskaperna hos ett läkemedel och för att identifiera potentiellt nya mål med kliniska konsekvenser. Flera metoder har rapporterats för att utföra en sådan screening. Emellertid, var och en har sina egna begränsningar (t. ex. screening av endast ATP-analoger, begränsning till att använda renade Kinas domäner, betydande kostnader i samband med testning mer än några kinaser i taget, och bristande flexibilitet i screening protein kinaser med nya mutationer). Här, ett nytt protokoll som övervinner några av dessa begränsningar och kan användas för opartisk screening av kinashämmare presenteras. En styrka av denna metod är dess förmåga att jämföra aktiviteten av kinashämmare över flera proteiner, antingen mellan olika kinaser eller olika varianter av samma Kinas. Självmonterade proteinmikromatriser som genereras genom uttrycket av proteinkinaser av en human-baserad in vitro-transkription och översättningssystem (IVTT) används. De proteiner som visas på mikromatrisen är aktiva, vilket möjliggör mätning av effekterna av kinashämmare. Följande procedur beskriver protokoll stegen i detalj, från generering av mikromatriser och screening till dataanalys.
Proteinkinaser är ansvariga för fosforyleringen av sina mål och kan modulera komplexa molekylära vägar som styr många cellulära funktioner (dvs. cell spridning, differentiering, celldöd och överlevnad). Avregleringen av Kinas aktivitet är förknippad med mer än 400 sjukdomar, vilket gör kinashämmare en av de viktigaste klasserna av läkemedel tillgängliga för behandling av flera sjukdomar, inklusive cancer, kardiovaskulära och neurologiska sjukdomar samt inflammatoriska och autoimmuna sjukdomar1,2,3.
Med tillkomsten av precisionsmedicin, identifiering av nya terapier, särskilt kinashämmare, har stor överklagande farmaceutiskt och kliniskt. Flera metoder kan användas för att identifiera möjliga nya par av Kinas/kinashämmare, inklusive de Novo utformningen av kinashämmare och identifiering av nya mål för befintliga FDA-godkända läkemedel. Den senare är särskilt attraktiv, eftersom den tid och pengar som krävs för att genomföra dessa läkemedel i kliniker reduceras drastiskt på grund av tillgängligheten av tidigare kliniska prövningar data. Ett kanoniskt exempel på återanvändning av en kinashämmare är imatinib, initialt avsett för behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) genom hämning av BCR-ABL, som också kan användas framgångsrikt för behandling av c-kit överuttrycker gastrointestinala stromacellstumörer (gister)4,5,6,7.
Screening av kinashämmare kan utföras i bindande analyser eller enzymatiska-baserade analyser. Den första klassen av analyser fokuserar på protein-läkemedelsinteraktioner och kan ge information såsom ligering webbplats och samhörighet. Eftersom aktiviteten av Kinas vid tidpunkten för dessa analyser är okänd, ett antal interaktioner kan missas eller falskeligen identifieras på grund av överensstämde förändringar i proteinet. Å andra sidan, enzymatiska-baserade analyser kräver proteinkinaser att vara aktiv och ge värdefull information om inhibitoren effekt på enzymaktivitet, emellertid, denna typ av screening är i allmänhet mer tidskrävande och dyrt. För närvarande är båda typerna av analyser kommersiellt tillgängliga från flera källor. De utgör ett tillförlitligt alternativ för screening av kinashämmare med några begränsningar, inklusive: I) de flesta av metoderna innebär testning av flera kinaser individuellt, vilket kan göra screening av en stor uppsättning av proteiner kostsamma; II) den uppsättning av kinaser som ska testas är begränsad till en förteckning över förvalda, vildtyps-kinaser och flera välkända muterade versioner av vissa kinaser, vilket hindrar testning av många nya muterade isoformer.
I detta sammanhang är proteinmikromatriser en kraftfull plattform som kan övervinna några av de begränsningar som presenteras av kommersiellt tillgängliga tekniker. Det är lämpligt att utföra enzymatiska-baserade analyser i hög dataflöde screening med full längd, aktiva proteiner i någon sekvens av intresse. Den Microarrays kan genereras av en självmonterad metod som NAPPA (nukleinsyra programmerbara protein array), där proteiner uttrycks precis i tid för analyser, öka sannolikheten för att de som visas på matrisen är verkligen aktiva. De proteiner som visas på NAPPA framställs med hjälp av humana-härledda ribosomer och chaperonproteiner för att förbättra sannolikheten för naturlig vikning och aktivitet.
Proteinerna programmeras initialt genom att skriva ut cDNAs kodning för gener av intresse smält med en Capture tag, tillsammans med en Capture agent, på microarray ytan. Proteinerna produceras sedan på mikroarrayer med hjälp av en in vitro-transkription och översättning (IVTT) system, och de nyligen uttryckta proteiner immobiliseras på microarray ytan av Capture agent. Uttryckta nappa matriser kan användas för studiet av de proteiner som visas på matrisen i en opartisk, hög genomströmning sätt8,9.
Tidigare, det visades att proteiner som visas på NAPPA arrayer viks ordentligt för att interagera med kända partners10; vidare utnyttjades deras enzymatiska aktivitet först i 2018, då det visades att proteinkinaser visades på microarrayen autophosphorylate11. Hittills har nappa metodik använts för många olika tillämpningar, inklusive biomarkör upptäckt12,13,14,15,16,17, protein-protein interaktioner10,18, substrat identifiering19, och Drug screening11. Dess flexibilitet är en av plattformens viktigaste egenskaper som möjliggör anpassning till varje applikation.
Här, ett protokoll för screening av tyrosinkinashämmare i självmonterade NAPPA arrayer presenteras. Plattformen är optimerad för visning av aktiva humana proteinkinaser och för analys av proteinkinas aktivitet, med låg bakgrund och hög dynamiskt omfång. Bland de ändringar som genomförs för att använda NAPPA för screening av kinashämmare inkluderar: I) förändringar i tryck kemi, II) de-fosforylering av proteinet microarray före kinashämmare screening, och III) optimering av detektion av fosforylerade proteiner på matrisen. Detta protokoll är den första i sitt slag och ger unik information om Kinas studie i nappa Microarrays.
Ändringar och felsökning
Under optimeringsfasen av studiet av Kinas aktivitet på NAPPA matriser, en av de viktigaste källorna till bakgrund och låg dynamiskt omfång observerats var BSA används på tryckning mix. BSA tillhandahöll de primära aminer som krävdes för tvärbindning med aminosilanytan och fångade DNA och Capture antikroppen på plats. BSA är dock mycket fosforylerat, vilket gör det svårt för detektion av autophosphorylation signalen på matrisen ovanför bakgrundsljud. För att lösa detta problem, flera alternativ för BSA i Tryck blandningen testades, och Poly-lysin identifierades som bra substitut. Poly-lysin saknar någon fosforylering webbplats; Därför är bakgrunden från icke-uttryckta matriser mycket minimal. Dessutom, Microarrays tryckt med poly-lysin är reproducerbara och Visa bra nivåer av proteiner (figur 2).
Nästa kritiska modifiering utförs på standard NAPPA analysen var tillsats av ett fosfatas/DNase behandlingssteg. Behandlingen av mikromatriser med fosfatas gör det möjligt att avlägsna all fosforylering som inträffade i IVTT-blandningen under proteinsyntesen och Capture (figur 3). Källan till denna fosforylering kan vara från inneboende autophosphorylation aktivitet eller från aktiviteten av kinaser närvarande i IVTT blandningen. Avlägsnandet av all fosforylering efter uttrycket tillät enkel identifiering av de kinaser som är aktiva och kan genomgå autophosphorylation (figur 3).
Kritiska steg inom protokollet
NAPPA är en robust teknik, men som väntat finns det flera kritiska steg. Den första är förvärvet av hög kvalitet DNA i lämplig koncentration. Med hjälp av DNA av dålig kvalitet eller i låga koncentrationer kommer att generera dålig kvalitet mikromatriser med flera funktioner som inte uttrycks och visas i lämpliga nivåer, minska antalet proteiner som analyseras på matrisen. Det andra kritiska steget är uttrycket av proteiner på mikromatrisen. Användningen av ett IVTT-system som kommer att uttrycka höga halter av funktionellt protein är avgörande för att studera Kinas aktivitet på matrisen.
Nästa kritiska steg på TKI-screeningen är hur mikroarrayer hanteras. Mikroarrayer bör inte torka under något steg i protokollet, och skonsam hantering rekommenderas för att förhindra repor som kan öka bakgrunds signalen. Eftersom matriserna från hela experimentet kommer att jämföras mot varandra är det viktigt att försäkra att varje inkubering steg är jämnt över alla bilder. Till exempel bör den tid som krävs för att utföra ett steg i en enda matris beaktas när en batch med 20 matriser bearbetas för att förhindra skillnader i längden på inkubering över matriser.
Slutligen är utformningen av experimentet och införandet av både positiva och negativa kontroller avgörande för kvalitetskontroll och dataanalys. Den första uppsättningen kontroller är de som skrivs ut i varje matris och innehåller negativa kontroller [dvs tomma fläckar (utan material tryckt), vatten eller tom vektor (endast uttryckliga taggen)], samt en positiv kontroll (dvs. renat IgG, som upptäcks av sekundär antikropp och är inert mot förändring i fosforyleringsnivåer). Tillsammans mäter de bakgrundsnivåerna i mikromatrisen, möjliga överföring under utskriften och signalintensiteten hos detektionsmetoden.
Nästa uppsättning kontroller är Drug screening kontroller och inkluderar defosforylerade och autophosphorylated mikromatriser (i närvaro eller frånvaro av DMSO). Som tidigare nämnts mäter den defosforylerade mikromatrisen nivån av fosforylering efter fosfatasbehandling och därmed basnivån för alla andra experiment. Ju lägre baslinjenivå är, desto högre dynamiskt omfång av analyserna. De autophosphorylated arrayer presentera den maximala fosforylering nivåer av alla arrayer och signalen bör vara stark och tydlig. Det används för dataanalys, men också som en kontroll att alla reaktioner utfördes framgångsrikt på matrisen.
Begränsningar av tekniken
Från och med nu, en av begränsningarna i drogen screening presenteras här är dess förmåga att avskärma endast proteinkinaser som kan vara autophosphorylated. Ett möjligt sätt att övervinna detta är att skriva ut en Kinas och kända substrat på samma plats. Co-Printing av DNA för två distinkta proteiner framgångsrikt åstadkommit15, vilket tyder på genomförbarheten av detta tillvägagångssätt. Dessutom kan proteinet som visas på matrisen inte vikas korrekt vilket resulterar i ett inaktivt protein. Användningen av mänskligt baserat uttrycks system gjorde en signifikant förbättring av Kinas aktivitet mätt på matrisen; men vissa proteiner kan fortfarande inte analyseras på matrisen på grund av dess inaktivitet.
En andra begränsning är mätningen av fosforylering med hjälp av en pan anti-Phospho-Tyr antikropp. Trots dess bristande specificitet när det gäller motivet på fosforylationsstället inträffade alla uppmätta fosforyleringar på tyrosinrester, vilket lämnade efter seriner och treoniner och deras respektive kinaser. Hittills har mer än 10 Pan Phospho-ser/THR antikroppar testats utan framgång, trots flera försök att optimera inkubering och tvätt villkor. Ett nytt detektionssystem som är oberoende av antikroppar kan vara det bästa alternativet för att utöka antalet proteinkinaser som kan undersökas för läkemedelshämmande. I detta sammanhang finns några alternativ tillgängliga, inklusive radioaktivitet eller kemiska metoder som Klicka konjugering. En serie optimeringar krävs för att minimera bakgrunds signalen och ge ett bra dynamiskt omfång för analyserna.
Den tredje begränsningen är förvärvet av cDNA-kloner som ska tryckas på matrisen. CDNA-klonerna kan genereras med hjälp av alla kloningstekniker, inklusive platsspecifika återkombinations system, till exempel Creator eller gateway23. Ett annat alternativ är att köpa klonerna från DNAsu biblioteket, finns på , där mer än 17 000 cDNAs kloner, inklusive hela mänskliga kinome, är lätt tillgänglig för att användas för byggande av NAPPA arrayer24 .
Den fjärde begränsningen är att inte varje laboratorium är utrustat med lämplig utrustning för att tillverka och avskärma sina egna NAPPA arrayer. Detta protokoll ger alternativa metoder för att generera DNA som ska skrivas ut på microarray, utan behov av hög kapacitet utrustning, och protokoll för att manuellt utföra alla hybridisering steg. Dock är tillgång till en arrayer och microarray Scanner fortfarande nödvändigt. Ett alternativ för att övervinna denna fråga är att använda NAPPA Core service och anläggning, finns på , som distribuerar anpassade NAPPA Microarrays till ett icke-vinstdrivande akademiska priset. Slutligen kan de data som erhålls på matriserna, liksom i alla screeningmetoder, vara mottagliga för artefakter (antingen positiva eller negativa) och bör därför valideras med hjälp av ortogonala analyser.
Betydelse med avseende på befintliga metoder
Flera plattformar finns kommersiellt tillgängliga för screening av proteinkinaser. En metod som används rutinmässigt är bindande analyser, som kan utföras med proteinfragment, Kinas domän, större proteinfragment med Kinas domän och vissa reglerande regioner, och även fullängds proteiner. Proteinerna uttrycks vanligtvis i bakteriella system på grund av kostnaden och enkelheten i uttrycket och renings protokollen. Samspelet mellan drogen av intresse och proteinet mäts sedan med någon typ av rapport assay som fluorescens eller förekomst av taggar, till exempel. Den huvudsakliga begränsningen av denna uppsättning av metoder är det faktum att proteinet inte nödvändigtvis är aktiv under interaktionen med drogen, vilket kan resultera i identifiering av falskt positiva och falskt negativa interaktioner. Proteinfragment är särskilt sårbara för förändringar i konformation och brist på aktivitet och alla data som erhålls bör valideras med hjälp av aktiva proteiner, företrädesvis i sin fullängds form. En annan begränsning av vissa av plattformarna är förmågan att avskärma endast ATP analoger, begränsa dess övergripande användning.
De flesta av de kommersiellt tillgängliga tjänster för screening av TKIs med enzymatiska baserade metoder utnyttja endast vilda typ versioner av Kinas intresse, och ibland bara en utvald några mutanter. Att veta att läkemedelsresistens är mycket vanligt hos patienter som behandlas med TKI, det är viktigt att kunna mäta läkemedelssvar i olika mutanter, för val av den lämpligaste hämmaren. På grund av NAPPAS natur, screening av Kinas mutanter är enkel och kan lätt åstadkommas, och det enda nödvändiga verktyget är införlivandet av Kinas Mutant i NAPPA cDNA samling, som kan göras genom platsspecifika mutagenes, till exempel.
Framtida tillämpningar
En av de vanligaste formerna av behandling förflyta i cancerbehandling med kinashämmare är förvärvet av mutationer i drogen målet under en behandling kurs. Screening av dessa mutanter avseende deras svar på kinashämmare är av avgörande betydelse för valet av andra/tredje generationen av TKIs för att uppnå en personlig behandling för varje patient. Den drog screening strategi som presenteras här, ger en opartisk screening plattform där någon tyrosinkinashämmare kan testas mot en panel av tyrosinkinaser som finns i det mänskliga genomet. Eftersom proteinerna som visas på NAPPA-matriserna uttrycks in vitro från cDNA tryckt på bilden, kan alla mutanta varianter enkelt införlivas i cDNA-samlingen för att visas på matrisen. Anläggningen där Kinas mutanter kan genereras och uttryckas på matrisen, kombinerat med den höga kapaciteten hos NAPPA-tekniken, ger en unik miljö för studiet av kinasmutanter och deras respons på läkemedel, vilket gör NAPPA lämpligt för personlig drog screening, ett av målen för precisionsmedicin.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla på LaBaer ‘ s Lab för deras hjälp och kritik under projektets utveckling. Detta projekt stöddes av NIH Grant U01CA117374, U01AI077883 och Virginia G. Piper Foundation.
Reagent/Material | |||
364 well plates (for arraying) | Genetix | x7020 | |
800 µL 96-well collection plate | Abgene | AB-0859 | |
96-pin device | Boekel | 140500 | |
Acetic Acid | Millipore-Sigma | 1.00066 | |
Acetone 99.9% | Millipore Sigma | 650501 | |
Aluminum seal for 96 well plates | VWR | 76004-236 | |
Aminosilane (3-aminopropyltriethoxysilane) | Pierce | 80370 | |
ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Millipore Sigma | F3165 | |
Anti-Flag rabbit Antibody (polyclonal) | Millipore Sigma | F7425 | |
ATP 10 mM | Cell Signaling | 9804S | |
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Millipore-Sigma | G9422 | |
bacteriological agar | VWR | 97064-336 | |
Blocking Buffer | ThermoFisher/Pierce | 37535 | |
Brij 35 | ThermoFisher/Pierce | BP345-500 | |
BS3 (bis-sulfosuccinimidyl) | ThermoFisher/Pierce | 21580 | |
BSA (bovine serum albumin) | Millipore Sigma | A2153 | |
Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 48393-106 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | |
DeepWell Block, case of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0661 | |
DEPC water | Ambion | 9906 | |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Millipore-Sigma | D8418 | |
DNA-intercalating dye | Invitrogen | P11495 | |
DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
DTT | Millipore-Sigma | 43816 | |
EDTA | Millipore-Sigma | EDS | |
Ethanol 200 proof | Millipore-Sigma | E7023 | |
Filter plates | Millipore-Sigma | WHA77002804 | |
Gas Permeable Seals, box of 50 | ThermoFisher/AbGene | AB-0718 | |
Glass box | Wheaton | 900201 | |
Glass slides | VWR | 48300-047 | |
Glycerol | Millipore-Sigma | G5516 | |
HCl (Hydrochloric acid) | Millipore-Sigma | H1758 | |
HEPES Buffer Solution | Millipore-Sigma | 83264 | |
Human-based IVTT system | Thermo Scientific | 88882 | |
ImmunoPure Mouse IgG whole molecule | ThermoFisher/Pierce | 31202 | |
Isopropanol | Millipore-Sigma | I9516 | |
KCl (Potassium chloride) | Millipore-Sigma | P9333 | |
KH2PO4(Potassium phosphate monobasic) | Millipore-Sigma | P5655 | |
Kinase buffer | Cell Signaling | 9802 | |
KOAc (Potassium acetate) | Millipore-Sigma | P1190 | |
Lambda Protein Phosphatase | new england biolabs | P0753 | |
Lifterslips, 24 x 60 mm | ThermoFisher Scientific | 25X60I24789001LS | |
Metal 30-slide rack with no handles | Wheaton | 900234 | |
MgCL2 (Magnesium chloride) | Millipore-Sigma | M8266 | |
Na3VO4 (Sodium orthovanadate) | Millipore-Sigma | S6508 | |
NaCl (Sodium Chloride) | Millipore-Sigma | S3014 | |
NaOAc (Sodium acetate) | Millipore-Sigma | S2889 | |
NaOH (Sodium hydroxide) | Millipore-Sigma | S8045 | |
NucleoBond Xtra Midi / Maxi | Macherey-Nagel | 740410.10 / 740414.10 | |
Nucleoprep Anion II | Macherey Nagel | 740503.1 | |
Phosphoric Acid | Millipore-Sigma | 79617 | |
Poly-L-Lysine Solution (0.01%) | Millipore-Sigma | A-005-C | |
Protein Phosphatase (Lambda) | New England Biolabs | P0753 | |
RNAse | Invitrogen | 12091021 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | L6026 | |
SDS (Sodium dodecyl sulfate) | Millipore-Sigma | 05030 | |
Sealing gasket | Grace Bio-Labs, Inc | 44904 | |
Silica packets | VWR | 100489-246 | |
Single well plate | ThermoFisher/Nalge Nunc | 242811 | |
Sodium acetate (3M, pH 5.5) | Millipore-Sigma | 71196 | |
TB media (Terrific Broth) | Millipore-Sigma | T0918 | |
Tris | IBI scientific | IB70144 | |
Triton X-100 | Millipore-Sigma | T8787 | |
Tryptone | Millipore-Sigma | T7293 | |
Tween 20 | Millipore-Sigma | P9416 | |
Yeast Extract | Millipore-Sigma | Y1625 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipments | Maker/model | ||
Programmable chilling incubator | Torrey Pines IN30 Incubator with Cooling | ||
Shaker for bacterial growth | ATR Multitron shaker | ||
Vacuum manifold with liquid waste trap | MultiScreenVacuum Manifold 96 well | ||
96 well autopippetor/liquid handler | Genmate or Biomek FX | ||
Liquid dispenser | Wellmate | ||
DNA microarrayer | Genetix QArray2 | ||
Automatic hybridization station | Tecan HS4800 Pro Hybridization Station | ||
Microarray scanner | Tecan PowerScanner | ||
Microarray data quantification | Tecan Array-ProAnalyzer 6.3 |