Presynapse Формирование Ассас использованием Presynapse Организатор бисера и "Нейрон мяч" Культура
Summary
Формирование пресинапсов является динамичным процессом, включая накопление синаптических белков в надлежащем порядке. В этом методе, presynapse образование вызвано бисером конъюгированный с протеином presynapse протеин на аксональных листах культуры «нейронного шара», так что накопление синаптических белков легко быть проанализированным во время образования presynapse.
Abstract
Во время развития нейронов, формирование синапса является важным шагом для создания нейронных цепей. Для формирования синапсов синаптические белки должны поставляться в надлежащем порядке путем транспортировки из клеточных органов и/или локального перевода в незрелые синапсы. Тем не менее, не до конца понял, как синаптические белки накапливаются в синапсах в надлежащем порядке. Здесь мы представляем новый метод анализа пресинаптического образования с помощью сочетания культуры нейронного шара с бисером, чтобы вызвать формирование пресинапсов. Нейронные шары, которые нейронных клеточных агрегатов обеспечивают аксональные листы вдали от клеточных тел и дендритов, так что слабые флуоресцентные сигналы пресинапсов могут быть обнаружены, избегая подавляющих сигналов клеточных тел. В качестве бисера, чтобы вызвать образование пресинапсов, мы используем бисер, спряженый с леуцином богатых повторить трансмембранных нейронов 2 (LRRTM2), возбуждающие пресинаптический организатор. Используя этот метод, мы продемонстрировали, что везикулярный глутаматный транспортер 1 (vGlut1), синаптический протеин везикл, накопленный в пресинапсах быстрее, чем Munc18-1, активный белок зоны. Munc18-1 накопился перевод-зависимо в presynapse даже после удаления клеточных органов. Этот вывод указывает на накопление Munc18-1 путем локального перевода в аксоны, а не транспорт из клеточных тел. В заключение, этот метод подходит для анализа накопления синаптических белков в пресинапсах и источнике синаптических белков. Поскольку культура нейронного шара проста и не обязательно использовать специальный аппарат, этот метод может быть применим к другим экспериментальным платформам.
Introduction
Формирование синапса является одним из важнейшихшагов при развитии нейронных цепей 1,2,3. Формирование синапсов, которые являются специализированными отсеками, состоящими из до- и пост-синапсов, представляет собой сложный и многоступенчатый процесс, включающий соответствующее распознавание аксонов и дендритов, формирование активной зоны и постсинаптической плотности, а также правильное выравнивание ионных каналов и нейромедиаторов рецепторов1,2. В каждом процессе, много видов синаптических протеинов аккумулируют к этим специализированным отсекам в правильном времени путем транспортировать синаптические протеины от тел клетки and/or местным переводом в отсеках. Эти синаптические белки считаются организованными, чтобы сформировать функциональные синапсы. Дисфункция некоторых синаптических белков, связанных собразованием синапсов, приводит к неврологическим заболеваниям 4,5. Тем не менее, остается неясным, как синаптические белки накапливаются в надлежащее время.
Чтобы исследовать, как синаптические белки накапливаются организованно, необходимо изучить накопление синаптических белков в хронологическом порядке. Некоторые доклады продемонстрировали живой визуализации наблюдать образование синапсов в разрозненных культуры нейронов6,7. Тем не менее, это отнимает много времени, чтобы найти нейроны, которые только начинают образование синапсов под микроскопией. Чтобы эффективно наблюдать накопление синаптических белков, образование синапса должно начинаться в то время, когда исследователи хотят вызвать образование. Вторая задача состоит в том, чтобы различать накопление синаптических белков из-за переноса из клеточных тел или локального перевода в синапсы. Для этого уровень перевода необходимо измерять при условии, что не допускается перенос синаптических белков из клеточных органов.
Мы разработали новый анализ формирования пресинапсов с использованием сочетания культуры нейронного шара с бисером, чтобы вызвать формирование пресинапсов8. Нейрон мяч культуры разработан для изучения аксонального фенотипа, в связи с образованием аксональных листов окружающих клеточных органов9,10. Мы использовали магнитные бусы, спряженые с леуцином богатых повторить трансмембранных нейронов 2 (LRRTM2), который является пресинаптическим организатором, чтобы вызвать возбуждающие presynapses (Рисунок 1A)11,12,13. С помощью бисера LRRTM2, образование presynapse начинается в то время, когда бусы применяются. Это означает, что формирование пресинапсов начинается в тысячах аксонов нейронного шара в одно и то же время, что позволяет эффективно изучить точный временной ход накопления синаптических белков. Кроме того, культуры нейронов мяч легко блокировать транспортные синаптические белки от сомы, удалив клеточные тела(Рисунок 1B)8. Мы уже подтвердили, что аксоны без клеточных тел могут выжить и здоровы по крайней мере 4 ч после удаления клеточных тел. Таким образом, этот протокол подходит для исследования, откуда получаются синаптические белки (клеточная часть тела или аксон) и как синаптические белки аккумулируются организованно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали новый метод для изучения образования пресинапсов, стимулируемых LRRTM2-шариками с использованием культуры нейронного шара. В настоящее время большая часть пресинапсового образования асса включает в себя поли-D-лизин (PDL)покрытием бисера и диссоциированной культуры / микро?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается JSPS Грант-в-помощь для научных исследований (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Сасаки). Мы благодарим д-ра Терукадзу Ноги и г-жу Макико Неязазаки (Городской университет Иокогамы) за любезное предоставление биотинилапопротого белка LRRTM2. Мы также благодарим Хонами Уэчи и Ри Исии за техническую помощь.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
