Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura

Shumaia Parvin; Renoma Takeda; Yukio Sasaki

doi:10.3791/59893

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Artigo de método

Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura

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DOI:

10.3791/59893

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2 de agosto de 2019

Shumaia Parvin¹ , Renoma Takeda¹ , Yukio Sasaki¹

¹Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

Neste artigo

Resumo

A formação de presynapse é um processo dinâmico que inclui a acumulação de proteínas sináptica na ordem apropriada. Neste método, a formação do presynapse é provocada pelos grânulos conjugados com uma proteína do organizador do presynapse em folhas axonal da cultura da esfera do Neuron do "", de modo que a acumulação de proteínas sináptica seja fácil de ser analisada durante a formação do presynapse.

Resumo

Durante o desenvolvimento neuronal, a formação de sinapse é um passo importante para estabelecer circuitos neurais. Para formar sinapses, as proteínas sinápticas devem ser fornecidas em ordem apropriada pelo transporte de corpos celulares e/ou tradução local em sinapses imaturas. No entanto, não é totalmente compreendido como as proteínas sinápticas se acumulam em sinapses em ordem adequada. Aqui, nós apresentamos um método novo para analisar a formação pré-sináptica usando a combinação da cultura da esfera do neurônio com os grânulos para induzir a formação do presynapse. As esferas do Neuron que são agregados da pilha neuronal fornecem as folhas axonal longe dos corpos e dos dendrites da pilha, de modo que os sinais fluorescentes fracos dos presynapses possam ser detectados evitando sinais esmagadores de corpos da pilha. Como grânulos para desencadear a formação de presynapse, usamos grânulos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), um organizador pré-sináptica excitatória. Usando este método, Nós demonstramos que o transportador vesicular 1 do glutamato (vGlut1), uma proteína sináptica do vesícula, acumulada em presynapses mais rapidamente do que Munc18-1, uma proteína da zona ativa. Munc18-1 acumulou a tradução-dependente no presynapse mesmo depois de remover corpos de pilha. Este achado indica o acúmulo de Munc18-1 por tradução local em axônios, não transporte de corpos celulares. Em conclusão, este método é apropriado analisar a acumulação de proteínas sináptica em presynapses e na fonte de proteínas sináptica. Como a cultura da esfera do neurônio é simples e não é necessário usar o instrumento especial, este método poderia ser aplicável a outras plataformas experimentais.

Introdução

A formação de sinapse é uma das etapas críticas durante o desenvolvimento de circuitos neurais^1,2^,3. A formação de sinapses especializadas em compartimentos compostos de pré e pós-sinapses é um processo complexo e multipasso que envolve o reconhecimento adequado de axônios e dendritos, formação de zona ativa e densidade pós-sináptica, e alinhamento adequado de canais iônicos e receptores neurotransmissores^1,2. Em cada processo, muitos tipos de proteínas sinápticas se acumulam a estes compartimentos especializados em t....