الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي
Summary
تفاصيل هذه المقالة استخدام مجموعة إعداد المكتبة متعددة التفاعلات المتعددة المثبتة على سلسلة من ردود الفعل تليها تسلسل الجيل التالي لتقييم انصهار الجينات الأنكجينية في عينات الورم الصلب السريرية. ويرد وصف لكل من خطوات المقاعد الرطبة وتحليل البيانات.
Abstract
غالباً ما تساهم الانصهارات الجينية في النمط الظاهري الأنسيوجيني للعديد من أنواع السرطان المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن وجود بعض الانصهارات في عينات من مرضى السرطان غالبا ما يؤثر بشكل مباشر على التشخيص، والتشخيص، و / أو اختيار العلاج. ونتيجة لذلك، أصبح الكشف الدقيق عن الانصهارات الجينية عنصرا حاسما في الإدارة السريرية للعديد من أنواع الأمراض. وحتى وقت قريب، كان الكشف عن الانصهار الجيني السريري يتم في الغالب من خلال استخدام الاختبارات أحادية الجينات. ومع ذلك، فإن قائمة من الانصهارات الجينية المتنامية مع الأهمية السريرية خلقت الحاجة إلى تقييم حالة الانصهار من الجينات متعددة في وقت واحد. وقد حقق الجيل التالي من الاختبارات المستندة إلى التسلسل (NGS) هذا الطلب من خلال القدرة على تسلسل الحمض النووي بطريقة موازية على نطاق واسع. وهناك نُهُج متعددة قائمة على المنظمات غير الحكومية تستخدم استراتيجيات مختلفة لإثراء الأهداف الجينية متاحة الآن للاستخدام في التشخيص الجزيئي السريري، ولكل منها نقاط القوة والضعف الخاصة بها. توضح هذه المقالة استخدام الترسب المتعدد المترسخ (AMP) القائم على إثراء الهدف وإعداد المكتبة متبوعاً بـ NGS لتقييم انصهار الجينات في عينات الورم الصلب السريرية. AMP هي فريدة من نوعها بين نهج التخصيب القائم على amplicon من حيث أنه يحدد الانصهارات الجينية بغض النظر عن هوية شريك الانصهار. وفيما يلي تفاصيل هذه الخطوات على حد سواء الرطب مقاعد البدلاء وتحليل البيانات التي تضمن الكشف الدقيق عن الانصهار الجينات من العينات السريرية.
Introduction
يمكن أن يحدث دمج اثنين أو أكثر من الجينات في كيان نسخي واحد نتيجة للاختلافات الكروموسومية على نطاق واسع بما في ذلك الحذف، والازدواجية، وعمليات الإدراج، والانحرافات، والتحويل. من خلال التحكم النسخي المتغير و / أو تغيير الخصائص الوظيفية للمنتج الجيني أعرب، يمكن أن تمنح هذه الجينات الانصهار خصائص أوجينيك للخلايا السرطانية1. في كثير من الحالات، ومن المعروف أن الجينات الانصهار بمثابة المحركات الأولية oncogenic عن طريق تفعيل مباشرة الانتشار الخلوي ومسارات البقاء على قيد الحياة.
أصبحت الأهمية السريرية للانصهار الجيني لمرضى السرطان واضحة لأول مرة مع اكتشاف كروموسوم فيلادلفيا وجين الانصهار BCR-ABL1 المقابل في ابيضاض الدم النقوي المزمن (CML)2. تم تطوير مثبطات الجزيء الصغير إيماتينيب ميسيلات لاستهداف هذا الجين الانصهار على وجه التحديد وأظهرت فعالية ملحوظة في BCR-ABL1إيجابية مرضى CML3. كما نجح الاستهداف العلاجي لاندماجات الجينات الأنكجينية في الأورام الصلبة، مع تثبيط الجينات الانصهارية ALK وROS1 في سرطان الرئة غير الصغير الخلايا التي تعمل كأمثلة أولية4،5. في الآونة الأخيرة، تم اعتماد مثبطات NTRK larotrectinib إدارة الأغذية والعقاقير لNTRK1/2/3 الأورام الصلبة الإيجابية الانصهار، بغض النظر عن موقع المرض6. وإلى جانب اختيار العلاج، فإن الكشف عن الانصهار الجيني له أيضاً أدوار في تشخيص الأمراض والتكهن بها. وينتشر هذا بشكل خاص في مختلف أنواع الساركوما والأورام الخبيثة الدموية التي يتم تعريفها تشخيصيا من خلال وجود انصهات محددة و / أو التي وجود الانصهار يعلم مباشرة التكهن7،8 , 9 , 10 سنوات , 11.هذه ليست سوى عدد قليل من الأمثلة على التطبيق السريري للكشف عن الانصهار الجينات لمرضى السرطان.
نظرا للدور الحاسم في صنع القرار السريري، الكشف الدقيق عن الانصهار الجيني من العينات السريرية هو ذو أهمية حيوية. وقد تم تطبيق العديد من التقنيات في المختبرات السريرية للانصهار أو تحليل إعادة ترتيب الكروموسومات بما في ذلك: تقنيات الخلايا الوراثية، والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR)، الفلورة في الموقع التهجين (FISH)، الكيمياء المناعية (IHC)، و 5’/3′ تحليل عدم التوازن التعبير (من بين أمور أخرى)12،13،14،15. وفي الوقت الحاضر، أدت القائمة الآخذة في الاتساع السريع للانصهار الجيني القابل للتنفيذ في السرطان إلى الحاجة إلى تقييم حالة انصهار جينات متعددة في وقت واحد. وبالتالي، فإن بعض التقنيات التقليدية التي لا يمكن هادىء أو عدد قليل من الجينات في وقت واحد أصبحت نُهجاً غير فعالة، خاصة عندما ننظر إلى أن عينات الورم السريري غالباً ما تكون محدودة جداً وغير قابلة للتقسيم بين عدة تجارب. ومع ذلك، فإن الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو منصة تحليل مناسبة تمامًا لاختبار الجينات المتعددة، وقد أصبحت الاختبارات المستندة إلى NGS شائعة في مختبرات التشخيص الجزيئي السريري.
وتختلف الاختبارات المستخدمة حالياً في مجال خدمات الإزالة الوطنية للكشف عن الانصهار/إعادة الترتيب فيما يتعلق بمواد المدخلات المستخدمة، والكيمياء المستخدمة في إعداد المكتبة والإثراء المستهدف، وعدد الجينات التي يتم الاستفسار عنها في إطار الاختبار. يمكن أن تستند اختبارات NGS إلى الحمض النووي الريبي (أو الحمض النووي (أو كليهما) المستخرجة من العينة. على الرغم من أن التحليل القائم على الحمض النووي الريبي يعوقه ميل العينات السريرية إلى احتواء الحمض النووي الريبي المتدهور للغاية، فإنه يتحايل على الحاجة إلى تسلسل الإينترونات الكبيرة والمتكررة في كثير من الأحيان التي هي أهداف لاختبار الانصهار القائم على الحمض النووي ولكن ثبت أن من الصعب على NGS تحليل البيانات16. ويمكن تقسيم استراتيجيات التخصيب المستهدفة لتجارب الـ NGS القائمة على الحمض النووي الريبي إلى حد كبير إلى نهج هجينة للالتقاط أو بوساطة أمبليسون. في حين تم استخدام كلتا الاستراتيجيتين بنجاح للكشف عن الانصهار، كل يحتوي على مزايا أكثر منغيرها 17،18. وعادة ما تؤدي الاختبارات الهجينة للالتقاط إلى مكتبات أكثر تعقيداً وتقلل من التسرب من الأليليك، في حين أن الاختبارات المستندة إلى amplicon تتطلب عموماً مدخلات أقل وتؤدي إلى تسلسل أقل خارج الهدف19. ومع ذلك، ربما يكون الحد الرئيسي من التخصيب التقليدي القائم على amplicon هو الحاجة إلى التمهيديات لجميع شركاء الانصهار المعروفة. وهذا أمر مثير للمشاكل لأن العديد من الجينات الهامة سريرياً معروفة بالصمامات مع عشرات الشركاء المختلفين، وحتى لو سمح التصميم التمهيدي بالكشف عن جميع الشركاء المعروفين، فإن أحداث الانصهار الجديدة ستظل غير مكتشفة. تقنية وصفت مؤخرا تسمى متعددة المضاعفات PCR (أو AMP لفترة قصيرة) يعالج هذا القيد20. في AMP، يتم ربط محول NGS ‘نصف وظيفية’ إلى أجزاء cDNA المشتقة من RNA الإدخال. يتم تحقيق الإثراء المستهدف عن طريق التضخيم بين التمهيديات الخاصة بالجين والتمهيدي إلى المحول. ونتيجة لذلك، ينبغي الكشف عن جميع عمليات الاندماج في الجينات ذات الأهمية، حتى لو كان هناك شريك جديد للانصهار (انظر الشكل1). توضح هذه المقالة استخدام مجموعة الأورام الصلبة ArcherDx FusionPlex، وهو اختبار يستند إلى NGS يستخدم AMP لإثراء الهدف وإعداد المكتبة، للكشف عن انصهار الجينات الأورام في عينات الورم الصلب (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة الجينات كاملة). وقد تم التحقق بدقة من بروتوكول مقاعد البدلاء الرطب ة وخطوات تحليل البيانات في مختبر معتمد من قبل تعديلات تحسين المختبرات السريرية (CLIA).
Protocol
Representative Results
Discussion
إن الإثراء المستهدف القائم على الـ PCR وتحضير المكتبة متبوعاً بالجيل التالي من التسلسل مناسبين لتقييم دمج الجينات المتعددة في عينات الأورام السريرية. من خلال التركيز على مدخلات الحمض النووي الريبي بدلا من الحمض النووي الجينومي، يتم تجنب الحاجة إلى تسلسل الإينترونات الكبيرة والمتكررة. با?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل الموارد المشتركة لعلم الأمراض الجزيئية من جامعة كولورادو (المعهد الوطني للسرطان مركز دعم مركز المنحة رقم. P30-CA046934) ومن قبل مركز كولورادو للطب الشخصي.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
