Onkogen Genfusions detektering ved hjælp af forankret multiplex Polymerasekæde reaktion efterfulgt af næste generations sekvensering
Summary
Denne artikel beskriver brugen af en forankret multiplex polymerase kæde reaktions baseret bibliotek forberedelse kit efterfulgt af næste generation sekventering at vurdere for onkogene gen fusioner i kliniske solide tumorprøver. Både våd-bænk og dataanalyse trin er beskrevet.
Abstract
Genfusioner bidrager ofte til den onkogene fænotype af mange forskellige typer kræft. Desuden, tilstedeværelsen af visse fusioner i prøver fra cancerpatienter ofte direkte påvirker diagnose, prognose, og/eller terapi udvælgelse. Som følge heraf er den nøjagtige påvisning af genfusioner blevet en kritisk komponent i klinisk administration for mange sygdomstyper. Indtil for nylig blev påvisning af klinisk genfusion fortrinsvis gennemført ved hjælp af Single-gen-assays. Den stadigt voksende liste over genfusioner med klinisk signifikans har imidlertid skabt et behov for at vurdere fusionens status for flere gener samtidigt. Next Generation sekventering (NGS)-baserede test har opfyldt dette krav gennem evnen til at sekvens af nukleinsyre i massivt parallel mode. Flere NGS-baserede tilgange, der anvender forskellige strategier for genmålberigelse, er nu tilgængelige til brug i klinisk Molekylær diagnostik, hver med sine egne styrker og svagheder. Denne artikel beskriver brugen af forankret multiplex PCR (AMP)-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af NGS til at vurdere for genfusioner i kliniske solide tumorprøver. AMP er unik blandt amplicon-baserede berigelse tilgange i, at det identificerer genfusioner uanset identiteten af fusions partneren. Detaljeret her er både de våde-bænk og dataanalyse trin, der sikrer nøjagtig genfusions detektering fra kliniske prøver.
Introduction
Sammensmeltningen af to eller flere gener i en enkelt transkriptional enhed kan forekomme som følge af store kromosomale variationer, herunder sletninger, gentagelser, indsættelser, inversioner og omplaceringer. Gennem ændret transkriptional kontrol og/eller ændrede funktionelle egenskaber af det udtrykte genprodukt kan disse fusions gener give onkogene egenskaber til kræftceller1. I mange tilfælde er fusions gener kendt for at fungere som primære onkogene chauffører ved direkte at aktivere cellulære proliferation og overlevelses veje.
Den kliniske relevans af genfusioner for cancerpatienter blev først tydelig med opdagelsen af Philadelphia kromosom og det tilsvarende BCR-ABL1-fusions- gen i kronisk myeloid leukæmi (CML)2. Den lille molekyle hæmmer Imatinib mesylat blev udviklet til specifikt at målrette dette fusions-gen og udviste en bemærkelsesværdig virkning hos BCR-ABL1-positive CML-patienter3. Terapeutisk målretning af onkogene gene fusioner har også været en succes i solide tumorer, med hæmning af ALK og ROS1 fusions gener i ikke-småcellet lungekræft tjener som primære eksempler4,5. For nylig, NTRK-hæmmer larotrectinib var FDA godkendt til NTRK1/2/3 fusion-positive solide tumorer, uanset sygdom site6. Ud over behandling udvælgelse, genfusion detektion har også roller i sygdoms diagnose og prognose. Dette er især fremherskende i forskellige sarkom og hæmatologiske maligniteter undertyper, der er diagnostisk defineret ved tilstedeværelsen af specifikke fusioner og/eller for hvilke tilstedeværelsen af en fusion direkte informerer prognose7,8 , 9 , 10 , 11. disse er blot nogle af eksemplerne på klinisk anvendelse af genfusions påvisning for cancerpatienter.
På grund af den kritiske rolle i den kliniske beslutningstagning er nøjagtig genfusions påvisning fra kliniske prøver af vital betydning. Der er anvendt talrige teknikker i kliniske laboratorier til analyse af fusions-eller kromosom reorganisering, herunder: cytogenetiske teknikker, reverse transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ-hybridisering (fisk), immunhistochemistry (IHC) og 5 ‘/3 ‘ Expression ubalance analyse (blandt andre)12,13,14,15. I øjeblikket, den hastigt voksende liste over handlingsrettede gen fusioner i kræft har resulteret i behovet for at vurdere fusion status af flere gener samtidigt. Derfor er nogle traditionelle teknikker, der kun kan forespørge en eller et par gener på et tidspunkt bliver ineffektive tilgange, især når man tænker på, at kliniske tumorprøver ofte er meget begrænsede og ikke modtagelig for at blive delt mellem flere assays. Next Generation sekventering (NGS) er imidlertid en analyseplatform, der er velegnet til multi-gen-testning, og NGS-baserede assays er blevet almindelige i kliniske molekylære diagnoselaboratorier.
Aktuelt anvendte NGS-assays til fusion/rearrangement-detektion varierer med hensyn til det anvendte inputmateriale, de kemiske stoffer, der anvendes til Biblioteks forberedelse og målberigelse, samt antallet af gener, som er forespurgt i en analyse. NGS-assays kan være baseret på RNA eller DNA (eller begge) udvundet fra prøven. Selv om RNA-baseret analyse hæmmes af tendensen i kliniske prøver til at indeholde stærkt forringet RNA, det omgår behovet for at sekvens store og ofte gentagne introner, der er mål for DNA-baseret fusions testning, men har vist sig at være vanskeligt for NGS dataanalyse16. Målberignings strategier for RNA-baserede NGS-analyser kan i vid udstrækning opdeles i hybrid indfangning eller amplicon-medierede tilgange. Mens begge strategier er blevet udnyttet med succes for fusion Detection, hver indeholder fordele i forhold til de andre17,18. Hybrid Capture assays resulterer generelt i mere komplekse biblioteker og reduceret allelisk Dropout, hvorimod amplicon-baserede assays generelt kræver lavere input og resulterer i mindre off-Target sekvensering19. Men måske den primære begrænsning af traditionel amplicon-baseret berigelse er behovet for primere til alle kendte fusions partnere. Dette er problematisk, da mange klinisk vigtige gener er kendt for at smelte med snesevis af forskellige partnere, og selv om primer design tilladt for påvisning af alle kendte partnere, nye fusion begivenheder vil forblive uopdaget. En nylig beskrevet teknik kaldet forankret multiplex PCR (eller AMP for Short) adresser denne begrænsning20. I AMP er en halv funktionel NGS-adapter ligeret til cDNA-fragmenter, der er afledt af input-RNA. Målberigelse opnås ved forstærkning mellem gene specifikke primere og en primer til adapteren. Som følge heraf bør alle fusioner af interesse gener, selv om der er tale om en ny fusions partner, påvises (Se figur 1). Denne artikel beskriver brugen af ArcherDx FusionPlex solid tumor kit, en NGS-baseret assay, der beskæftiger AMP for Target berigelse og bibliotek forberedelse, til påvisning af onkogene genfusioner i solide tumor prøver (Se supplerende tabel 1 for komplet genliste). Wet-Bench protokol og dataanalyse trin er blevet strengt valideret i et klinisk laboratorium forbedring ændringer (CLIA)-certificeret laboratorium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forankret multiplex PCR-baseret Target berigelse og bibliotek forberedelse efterfulgt af næste generation sekvensering er velegnet til multiplexed gen fusion vurdering i kliniske tumorprøver. Ved at fokusere på RNA-input i stedet for genomisk DNA undgås behovet for at sekvens store og gentagne introner. Desuden, da denne fremgangsmåde forstærker genfusioner uanset identiteten af fusions partneren, opdages nye fusioner. Dette er en kritisk fordel i det kliniske rige, og der har været mange eksempler på handlingsre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den molekylære patologi delte ressource af University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) og af Colorado Center for personlig medicin.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
