Detecção de fusão gênica oncogênica usando a reação em cadeia de polimerase multiplex ancorada seguida por sequenciamento da próxima geração

Resumo

Este artigo detalha o uso de um kit de preparação de biblioteca com base em reação em cadeia do polymerase multiplex seguido de sequenciamento de próxima geração para avaliar as fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos clínicos. As etapas de análise de dados e de bancada úmida são descritas.

Resumo

As fusões do gene contribuem freqüentemente ao phenotype oncogênico de muitos tipos diferentes de cancro. Adicionalmente, a presença de certas fusões em amostras de pacientes oncológicos muitas vezes influencia diretamente o diagnóstico, o prognóstico e/ou a seleção da terapia. Em conseqüência, a deteção exata de fusões do gene transformou-se um componente crítico da gerência clínica para muitos tipos da doença. Até recentemente, a deteção clínica da fusão do gene foi realizada predominante com o uso de ensaios do único-gene. No entanto, a lista cada vez maior de fusões de genes com significância clínica criou uma necessidade de avaliar o status de fusão de múltiplos gene simultaneamente. Os testes baseados em sequenciamento da próxima geração (NGS) atenderam a essa demanda através da capacidade de sequenciar o ácido nucleico de forma massivamente paralela. Várias abordagens baseadas em NGS que empregam diferentes estratégias para o enriquecimento de alvos de genes estão agora disponíveis para uso em diagnósticos moleculares clínicos, cada um com seus próprios pontos fortes e fracos. Este artigo descreve o uso do enriquecimento do alvo do multiplex da PCR (ampère)-baseado ancorado e da preparação da biblioteca seguidos por NGS para avaliar para fusões do gene em espécimes contínuos clínicos do tumor. O AMP é único entre abordagens de enriquecimento baseadas em amplicon, pois identifica fusões genéticas, independentemente da identidade do parceiro de fusão. Detalhado aqui estão as etapas da análise do molhado-banco e de dados que asseguram a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas.

Introdução

A fusão de dois ou mais genes em uma única entidade transcricional pode ocorrer como o resultado de variações cromossomáticas da grande escala que incluem deleções, duplicações, inserções, Inversions, e translocations. Por meio do controle transcricional alterado e/ou das propriedades funcionais alteradas do produto genético expresso, esses genes de fusão podem conferir propriedades oncogênicas a células cancerosas¹. Em muitos casos, os genes da fusão são sabidos para actuar como excitadores oncogênico preliminares ativando diretamente a proliferação celular e as vias de sobrevivência.

A relevância clínica de fusões ....

Protocolo

1. preparação e sequenciamento de bibliotecas

1. Considerações gerais sobre o ensaio e etapas de pré-ensaio
   1. As funcionamentos do ensaio consistem tipicamente em sete amostras clínicas e em um controle positivo (embora o número de amostras por a execução da preparação da biblioteca possa ser ajustado como necessário). Use um controle positivo que contenha pelo menos diversas fusões genéticas (que os alvos do ensaio) que foram confirmados por um fabricante e/ou tenham sido confirmados por uma metodologia ortogonal. Um controle não-modelo (NTC) deve ser incluído como uma amostra adicional em cada ensaio executado, mas só é realizado atra....

Resultados

Mostrado na Figura 3, figura 4 e Figura 5 são capturas de tela da interface de usuário de análise demonstrando resultados de uma amostra de adenocarcinoma de pulmão. Na Figura 3, o resumo da amostra é mostrado (superior) que lista as fusões de evidência fortes chamadas, bem como o status de QC (circulado em vermelho). A fusão de ADCK4-numbl (de que 3 isoformas é alistada) é ignorada imediatamen.......

Discussão

O enriquecimento de alvo baseado em PCR multiplex e a preparação da biblioteca seguidos por sequenciamento de próxima geração são adequados para a avaliação de fusão genética multiplexada em amostras de tumores clínicos. Focalizando na entrada do RNA um pouco do que o ADN genomic, a necessidade de sequenciar íntrons grandes e repetitivos é evitada. Adicionalmente, desde que esta aproximação amplifica fusões do gene não obstante a identidade do sócio da fusão, as fusões novas são detectadas. Esta é uma vantagem crítica no.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	Usado para diluição TNA
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	Usado em pool de biblioteca
Reservatório de reagente de 25 mL com divisor	USA Scientific	9173-2000	Para uso com pipetadores multicanal e grandes volumes de reagentes
Semi-saia TemPlate de 96 poços 0.1mL PCR plate-natural	USA Scientific	1402-9700	Placa usada para etapas de termociclador
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	Usado na purificação após várias etapas de ensaio
Agencourt Formapure Kit	Beckman Coulter	A33343	Usado na extração TNA
Archer FusionPlex Solid Tumor kit	ArcherDX	AB0005	Este kit contém a maioria dos reagentes necessários para realizar a preparação da biblioteca para sequenciamento Illumina (kits para sequenciamento Ion Torrent também estão disponíveis)
Bloco frio, 96 poços	Light Labs	A7079	Usado para manter amostras resfriadas em várias etapas
Etanol	Decon Labs	DSP-MD.43	Usado para lavagens de esferas
Quantificação de biblioteca para Illumina Padrão de Controle Interno	Kapa Biosystems	KK4906	Usado para quantificação de bibliotecas
Biblioteca Quantificação Primers e ROX Baixa mistura de qPCR	Kapa Biosystems	KK4973	Usado para quantificação de bibliotecas
Padrões de quantificação de bibliotecas	Kapa Biosystems	KK4903	Usado para quantificação de bibliotecas
Placa magnética, 96 poços (grau N38)	Alpaqua	A32782	Usado em etapas de purificação de esferas
Conjunto de adaptadores MBC B	ArcherDX	AK0016-48	Adaptadores que contêm índices específicos de amostra para permitir o sequenciamento multiplex
Micro Centrifuge	USA Scientific	2641-0016	Usado para girar tubos de PCR
MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de 96 poços	Thermo-Fisher	4483485	Usado para quantificação de biblioteca QClibrary Microamp
Almofada de compressão de filme óptico	Applied Biosystems	4312639	Usado para quantificação de biblioteca
Mini Plate Spinner		Labnet MPS-1000	Usado para coletar líquido no fundo de poços de placas
Kit de Reagentes MiSeq v3 (600 ciclos)	Illumina	MS-102-3003	Contém componentes necessários para uma execução de sequenciamento MiSeq
Sistema MiSeqDx	Illumina		NGS Sequencing
Instrument Modelo 9700 Thermocycler	Applied Biosystems		Usado para várias etapas durante ensaio
de água livre de nuclease	Ambion	9938	Usado como diluente geral
ABI óptico Tampas de placa de PCR de 96 poços	Thermo-Fisher	4311971	Usado para quantificação de QClibrary Pre-Seq
Estação de trabalho de PCR Modelo 600	Sistemas de limpeza de ar	BZ10119636	Etapas de ensaio de bancada úmida realizadas nesta 'caixa de ar morto'Proteinase
K	Qiagen	1019499	Usado na extração da TNA
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	instrumento qPCR usado para quantificação de PreSeq e biblioteca
Kit de ensaio Qubit RNA HS	Life Technologies	Q32855	Uso para determinar a concentração de RNA em amostras de TNA
RNase Away	Fisher	12-402-178	Usado para descontaminação geral de RNase de áreas de trabalho
Seraseq FFPE Material de referência de RNA de fusão tumoral v2	SeraCare	0710-0129	Usado como ensaio de controle positivo
Hidróxido de Sódio		Fisher BP359-212	Usado em etapas de limpeza e para configuração de sequenciamento
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	Componente do Ensaio de QC PreSeq
TempAssure PCR 8-tube Strips	USA Scientific	1402-2700	Usado para mistura de reagentes e amostras, etc.
Modelo RT PCR filme	EUA Scientific	2921-7800	Usado para cobrir placas de 96 poços
U-Bottom 96-well Microplate	LSP	MP8117-R	Usado durante a purificação do grânulo