Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie
Summary
Dit artikeldetails het gebruik van een verankerde multiplex polymerase keten reactie gebaseerde bibliotheek Voorbereidingspakket gevolgd door de volgende generatie sequencing om te beoordelen voor oncogene gen fusies in klinische solide tumormonsters. Zowel de natte bank als de gegevensanalyse stappen worden beschreven.
Abstract
Gen-fusies dragen vaak bij aan het oncogene fenotype van veel verschillende soorten kanker. Bovendien beïnvloedt de aanwezigheid van bepaalde fusies in monsters van kankerpatiënten vaak rechtstreeks de diagnose, prognose en/of therapie selectie. Als gevolg hiervan is de nauwkeurige detectie van genfusies een essentieel onderdeel van het klinisch beheer voor vele ziekte types geworden. Tot voor kort werd klinische genfusie detectie voornamelijk bewerkstelligd door het gebruik van enkelvoudige assays. De steeds groeiende lijst van genfusies met klinische significantie heeft echter een noodzaak gecreëerd om de fusie status van meerdere genen gelijktijdig te beoordelen. Tests van de volgende generatie sequencing (NGS) hebben aan deze vraag voldaan door het vermogen om nucleïnezuur te sequentiëren in massaal parallelle mode. Meerdere op NGS gebaseerde benaderingen die verschillende strategieën hanteren voor gendoel verrijking zijn nu beschikbaar voor gebruik in klinische moleculaire diagnostiek, elk met zijn eigen sterke en zwakke punten. Dit artikel beschrijft het gebruik van verankerde multiplex PCR (AMP)-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door NGS om te beoordelen op genfusies in klinische solide tumor specimens. AMP is uniek onder de op amplicon gebaseerde verrijkings benaderingen, omdat het genen fusies identificeert, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Gedetailleerd hier zijn zowel de natte bank en data analysestappen die zorgen voor nauwkeurige genfusie detectie van klinische monsters.
Introduction
De fusie van twee of meer genen in één transcriptionele entiteit kan optreden als gevolg van grootschalige chromosomale variaties, waaronder verwijderingen, duplicaties, inserties, Inversies en translocaties. Door veranderde Transcriptionele controle en/of veranderde functionele eigenschappen van het uitgedrukte genproduct, kunnen deze fusie genen oncogene eigenschappen toekennen aan kankercellen1. In veel gevallen, Fusion genen zijn bekend om op te treden als primaire oncogene drivers door het direct activeren cellulaire proliferatie en overleving trajecten.
De klinische relevantie van genfusies voor kankerpatiënten werd voor het eerst duidelijk met de ontdekking van het Philadelphia-chromosoom en het overeenkomstige BCR-ABL1-fusie- gen in chronische myeloïde LEUKEMIE (CML)2. De kleine molecule remmer Imatinib mesylate werd ontwikkeld om specifiek te richten op dit fusie-gen en toonde opmerkelijke werkzaamheid bij BCR-ABL1-positieve cml patiënten3. Therapeutische targeting van oncogene genen fusies is ook succesvol geweest in solide tumoren, met remming van alk pt ROS1 fusie genen in niet-kleincellige longkanker die fungeert als primaire voorbeelden4,5. Onlangs was de NTRK-remmer larotrectinib FDA goedgekeurd voor NTRK1/2/3 fusie-positieve vaste tumoren, ongeacht de ziekte plaats6. Naast de selectie van de therapie, heeft genfusie detectie ook rollen in ziekte diagnoses en prognose. Dit komt vooral voor in verschillende Sarcoom en hematologische maligniteiten die door de aanwezigheid van specifieke fusies en/of voor de aanwezigheid van een fusie direct worden bepaald aan de hand van de prognose7,8 , 9 , 10 , 11. Dit zijn slechts enkele voorbeelden van de klinische toepassing van genfusie detectie voor kankerpatiënten.
Vanwege de cruciale rol bij klinische besluitvorming is nauwkeurige genfusie detectie uit klinische monsters van vitaal belang. In klinische laboratoria zijn talrijke technieken toegepast voor de analyse van fusie-of chromosomale omlegging, waaronder: cytogenetische technieken, omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR), fluorescentie in situ-hybridisatie (vis), Immunohistochemie (IHC), en 5 ‘/3 ‘ expressie onbalans analyse (onder andere)12,13,14,15. Op dit moment heeft de snel uitbreidende lijst van bruikbare gen-fusies in kanker geresulteerd in de noodzaak om de fusie status van meerdere genen tegelijkertijd te beoordelen. Bijgevolg zijn sommige traditionele technieken die slechts één of een paar genen tegelijk kunnen opvragen steeds inefficiënte benaderingen, vooral wanneer men bedenkt dat klinische tumormonsters vaak zeer eindig zijn en niet vatbaar zijn voor verdeling tussen verschillende assays. Next generation sequencing (NGS) is echter een analyseplatform dat goed geschikt is voor multi-Gene testen, en op NGS gebaseerde assays zijn gebruikelijk geworden in klinisch moleculaire diagnostische laboratoria.
Momenteel gebruikte NGS assays voor fusie/herschikking detectie variëren met betrekking tot de gebruikte input materiaal, de chemici gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek en de doel verrijking, en het aantal genen opgevraagd binnen een assay. NGS-testen kunnen worden gebaseerd op RNA of DNA (of beide) geëxtraheerd uit het monster. Hoewel RNA-gebaseerde analyse wordt belemmerd door de neiging van klinische monsters om sterk aangetast RNA te bevatten, omzeilt het de noodzaak om grote en vaak herhaalde intron te sequenties die de doelwitten zijn van DNA-gebaseerde fusie tests, maar die moeilijk zijn voor ngs gegevensanalyse16. Doel verrijkings strategieën voor op RNA gebaseerde NGS-testen kunnen grotendeels worden onderverdeeld in hybride Capture of amplicon-gemedieerde benaderingen. Hoewel beide strategieën met succes zijn gebruikt voor fusie detectie, bevat elk voordelen ten opzichte van de andere17,18. Hybrid Capture assays resulteren meestal in complexere bibliotheken en verminderen allel dropout, terwijl amplicon gebaseerde assays in het algemeen lagere input vereisen en resulteren in minder doel volgorde19. Echter, misschien is de primaire beperking van traditionele amplicon gebaseerde verrijking de noodzaak voor primers aan alle bekende fusie partners. Dit is problematisch omdat veel klinisch belangrijke genen bekend zijn met tientallen verschillende partners, en zelfs als het ontwerp van de primer de detectie van alle bekende partners toestaat, blijven nieuwe fusie gebeurtenissen onopgemerkt. Een recent beschreven techniek genaamd verankerde multiplex PCR (of AMP voor short) lost deze beperking op20. In amp wordt een ‘ half-functionele ‘ ngs-adapter geligeerd aan cDNA-fragmenten die zijn afgeleid van input RNA. Doel verrijking wordt bereikt door versterking van genspecifieke primers en een primer op de adapter. Dientengevolge moeten alle fusies met genen die van belang zijn, zelfs als er een nieuwe fusie partner bij betrokken is, worden opgespoord (Zie Figuur 1). Dit artikel beschrijft het gebruik van de ArcherDx FusionPlex Solid tumor Kit, een op NGS gebaseerde assay die AMP gebruikt voor doel verrijking en bibliotheek voorbereiding, voor de detectie van oncogene gen fusies in vaste tumormonsters (Zie aanvullende tabel 1 voor volledige genlijst). Het NAT-Bench protocol en de stappen voor gegevensanalyse zijn grondig gevalideerd in een laboratorium voor de verbetering van de klinische laboratorium wijzigingen (CLIA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Verankerde multiplex PCR-gebaseerde doel verrijking en bibliotheek voorbereiding gevolgd door sequencing van de volgende generatie is zeer geschikt voor Multiplexed genfusie beoordeling in klinische tumormonsters. Door te focussen op RNA input in plaats van genomisch DNA, wordt de noodzaak om grote en repetitieve intronen te sequenties vermeden. Bovendien worden nieuwe fusies gedetecteerd, aangezien deze aanpak genfusies versterkt, ongeacht de identiteit van de fusie partner. Dit is een kritisch voordeel in de klinische …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de moleculaire pathologie gedeelde bron van de Universiteit van Colorado (National Cancer Institute Cancer Center ondersteuning Grant No. P30-CA046934) en door het centrum van Colorado voor gepersonaliseerde geneeskunde.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
