Détection de fusion génique oncogène utilisant la réaction ancrée de chaîne de polymérase de multiplex suivie du séquençage de prochaine génération
Summary
Cet article détaille l’utilisation d’un kit de préparation de bibliothèque de chaîne de polymérase de multiplex ancré de chaîne suivi du séquençage de prochaine génération pour évaluer des fusions de gène oncogènes dans les échantillons solides cliniques de tumeur. Les étapes de l’analyse des bancs humides et des données sont décrites.
Abstract
Les fusions de gènes contribuent fréquemment au phénotype oncogène de nombreux types de cancer. En outre, la présence de certaines fusions dans les échantillons de patients atteints de cancer influence souvent directement le diagnostic, le pronostic et/ou la sélection thérapeutique. En conséquence, la détection précise des fusions de gènes est devenue un composant essentiel de la gestion clinique pour de nombreux types de maladies. Jusqu’à récemment, la détection clinique de fusion de gène a été principalement accomplie par l’utilisation des essais d’un seul gène. Cependant, la liste sans cesse croissante des fusions de gènes ayant une signification clinique a créé un besoin d’évaluer simultanément l’état de fusion de plusieurs gènes. Les tests basés sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) ont répondu à cette demande grâce à la capacité de séquencer l’acide nucléique de façon massivement parallèle. Plusieurs approches basées sur NGS qui utilisent différentes stratégies d’enrichissement des cibles génétiques sont maintenant disponibles pour une utilisation dans le diagnostic moléculaire clinique, chacun avec ses propres forces et faiblesses. Cet article décrit l’utilisation de l’enrichissement cible et de la préparation de la bibliothèque à base de multiplex ancré pcR (AMP) suivis de NGS pour évaluer les fusions de gènes chez les spécimens cliniques de tumeurs solides. L’AMP est unique parmi les approches d’enrichissement à base d’amplicon en ce qu’elle identifie les fusions de gènes indépendamment de l’identité du partenaire de fusion. Les étapes d’analyse des données et de la banque mouillée qui assurent une détection précise de la fusion des gènes à partir d’échantillons cliniques sont détaillées ici.
Introduction
La fusion de deux gènes ou plus en une seule entité transcriptionnelle peut se produire à la suite de variations chromosomiques à grande échelle, y compris des suppressions, des duplications, des insertions, des inversions et des translocations. Grâce à un contrôle transcriptionnel altéré et/ou à des propriétés fonctionnelles altérées du produit génique exprimé, ces gènes de fusion peuvent conférer des propriétés oncogènes aux cellules cancéreuses1. Dans de nombreux cas, les gènes de fusion sont connus pour agir comme principaux moteurs oncogènes en activant directement la prolifération cellulaire et les voies de survie.
La pertinence clinique des fusions de gènes pour les patients atteints de cancer est d’abord devenue évidente avec la découverte du chromosome de Philadelphie et du gène de fusion BCR-ABL1 correspondant dans la leucémie myélogène chronique (LMC)2. Le petit inhibiteur de molécule imatinib mesylate a été développé pour cibler spécifiquement ce gène de fusion et a démontré l’efficacité remarquable dans les patients BCR-ABL1-positifs de CML3. Le ciblage thérapeutique des fusions de gènes oncogènes a également été couronné de succès dans les tumeurs solides, avec l’inhibition des gènes de fusion ALK et ROS1 dans le cancer du poumon non à petites cellules servant d’exemples primaires4,5. Récemment, le larotrectinib inhibiteur de NTRK a été FDA approuvé pour NTRK1/2/3 fusion-positives tumeurs solides, indépendamment du site de la maladie6. Au-delà de la sélection thérapeutique, la détection de la fusion des gènes a également des rôles dans le diagnostic et le pronostic de la maladie. Ceci est particulièrement répandu dans divers sous-types de sarcome et de malignité hématifique qui sont diagnostiquement définis par la présence de fusions spécifiques et/ou pour lesquels la présence d’une fusion informe directement le pronostic7,8 , 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. Ce ne sont là que quelques exemples de l’application clinique de la détection de la fusion génétique chez les patients atteints de cancer.
En raison du rôle critique dans la prise de décision clinique, la détection précise de fusion de gène des échantillons cliniques est d’une importance vitale. De nombreuses techniques ont été appliquées dans les laboratoires cliniques pour la fusion ou l’analyse de réarrangement chromosomique, y compris: techniques cytogénétiques, transcription inverse réaction en chaîne de polymérase (RT-PCR), fluorescence in situ hybridation (FISH), immunohistochemistry (IHC), et 5’/3′ analyse de déséquilibre d’expression (entre autres)12,13,14,15. À l’heure actuelle, la liste en pleine expansion des fusions de gènes exploitables dans le cancer a entraîné la nécessité d’évaluer simultanément l’état de fusion de plusieurs gènes. Par conséquent, certaines techniques traditionnelles qui ne peuvent interroger qu’un ou quelques gènes à la fois deviennent des approches inefficaces, surtout si l’on considère que les échantillons cliniques de tumeurs sont souvent très finis et ne peuvent être divisés entre plusieurs essais. Le séquençage de nouvelle génération (NGS), cependant, est une plate-forme d’analyse qui est bien adaptée pour l’essai multigène, et les essais basés sur NGS sont devenus communs dans les laboratoires cliniques de diagnostic moléculaire.
Les tests NGS actuellement utilisés pour la détection de fusion/réarrangement varient en ce qui concerne le matériel d’entrée utilisé, les chimies utilisées pour la préparation des bibliothèques et l’enrichissement des cibles, et le nombre de gènes interrogés dans le cadre d’un essai. Les analyses NGS peuvent être basées sur l’ARN ou l’ADN (ou les deux) extraits de l’échantillon. Bien que l’analyse à base d’ARN soit entravée par la tendance des échantillons cliniques à contenir de l’ARN hautement dégradé, elle contourne la nécessité de séquencer des introns grands et souvent répétitifs qui sont la cible d’essais de fusion à base d’ADN, mais qui se sont avérés difficiles pour ngS. analyse des données16. Les stratégies d’enrichissement cible pour les essais NGS à base d’ARN peuvent être largement divisées en approches hybrides de capture ou d’amplicon-négociées. Bien que les deux stratégies aient été utilisées avec succès pour la détection de la fusion, chacune contient des avantages par rapport aux17autres,18. Les essais de capture hybrides entraînent généralement des bibliothèques plus complexes et réduisent le décrochage allélique, tandis que les essais à base d’amplicon nécessitent généralement moins d’entrée et se traduisent par un séquençage moins hors cible19. Cependant, peut-être la principale limitation de l’enrichissement traditionnel à base d’amplicon est la nécessité d’amorces pour tous les partenaires de fusion connus. Ceci est problématique puisque de nombreux gènes cliniquement importants sont connus pour fusionner avec des dizaines de partenaires différents, et même si la conception d’amorce a permis la détection de tous les partenaires connus, les événements de fusion nouvelles resteraient inaperçus. Une technique récemment décrite appelée multiplexe ancré PCR (ou AMP pour faire court) aborde cette limitation20. Dans l’AMP, un adaptateur NGS « demi-fonctionnel » est collé à des fragments d’ADNc qui sont dérivés de l’ARN d’entrée. L’enrichissement ciblé est réalisé par amplification entre des amorces spécifiques au gène et une amorce à l’adaptateur. Par conséquent, toutes les fusions avec des gènes d’intérêt, même si un nouveau partenaire de fusion est impliqué, doivent être détectées (voir La figure 1). Cet article décrit l’utilisation du kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un essai basé sur NGS qui utilise l’AMP pour l’enrichissement des cibles et la préparation de la bibliothèque, pour la détection des fusions de gènes oncogènes dans des échantillons de tumeurs solides (voir tableau supplémentaire 1 pour liste complète des gènes). Le protocole de banc humide et les étapes d’analyse des données ont été rigoureusement validés dans un laboratoire certifié par le Laboratoire d’amélioration des laboratoires cliniques (CLIA).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’enrichissement cible et la préparation de la bibliothèque à base de multiplex À base de PCR, suivis d’un séquençage de nouvelle génération, sont bien adaptés à l’évaluation de la fusion des gènes multiplexés dans les échantillons cliniques de tumeurs. En mettant l’accent sur l’apport d’ARN plutôt que sur l’ADN génomique, la nécessité de séquencer des introns grands et répétitifs est évitée. De plus, puisque cette approche amplifie les fusions génétiques indépendamment de l’identité du partena…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Molecular Pathology Shared Resource de l’Université du Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) et par le Colorado Center for Personalized Medicine.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
