Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.
Abstract
Genfusionen tragen häufig zum onkogenen Phänotyp vieler verschiedener Krebsarten bei. Darüber hinaus beeinflusst das Vorhandensein bestimmter Fusionen in Proben von Krebspatienten häufig direkt die Diagnose, Prognose und/oder Therapieauswahl. Infolgedessen ist der genaue Nachweis von Genfusionen für viele Krankheitstypen zu einem kritischen Bestandteil des klinischen Managements geworden. Bis vor kurzem wurde der klinische Genfusionsnachweis überwiegend durch den Einsatz von Single-Gen-Assays durchgeführt. Die ständig wachsende Liste von Genfusionen mit klinischer Bedeutung hat jedoch dazu führen, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. NGS-basierte Tests der nächsten Generation haben diese Nachfrage durch die Fähigkeit, Nukleinsäure massiv parallel zu sequenzieren, erfüllt. Mehrere NGS-basierte Ansätze, die unterschiedliche Strategien für die Genzielanreicherung anwenden, stehen nun für den Einsatz in der klinischen Molekulardiagnostik zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken und Schwächen haben. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von verankerter Multiplex-PCR (AMP)-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von NGS, um Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. AMP ist einzigartig unter Amplikon-basierten Anreicherungsansätzen, da es Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners identifiziert. Hier sind sowohl die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte aufgeführt, die einen genauen Genfusionsnachweis aus klinischen Proben gewährleisten.
Introduction
Die Verschmelzung von zwei oder mehr Genen zu einer einzigen transkriptionellen Einheit kann als Ergebnis großflächiger chromosomaler Variationen auftreten, einschließlich Deletionen, Duplizierungen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Durch veränderte Transkriptionskontrolle und/oder veränderte funktionelle Eigenschaften des exprimierenden Genprodukts können diese Fusionsgene Krebszellen onkogene Eigenschaften verleihen1. In vielen Fällen sind Fusionsgene dafür bekannt, als primäre onkogene Treiber zu fungieren, indem sie die Zellproliferation und Überlebenswege direkt aktivieren.
Die klinische Relevanz von Genfusionen für Krebspatienten wurde erstmals durch die Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms und des entsprechenden BCR-ABL1-Fusionsgens bei chronischer myelogenöser Leukämie (CML)2deutlich. Der kleine Molekülinhibitor Imatinib-Mesylat wurde speziell für dieses Fusionsgen entwickelt und zeigte eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei BCR-ABL1-positivenCML-Patienten3. Die therapeutische Ausrichtung auf onkogene Genfusionen war auch bei soliden Tumoren erfolgreich, wobei die Hemmung von ALK- und ROS1-Fusionsgenen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs als primäre Beispiele 4,5dient. Kürzlich wurde der NTRK-Hemmer Larotrectinib von der FDA für NTRK1/2/3 fusionspositive solide Tumoren zugelassen, unabhängig von der Krankheitsstelle6. Neben der Therapieauswahl spielt der Genfusionsnachweis auch eine Rolle in der Krankheitsdiagnose und -prognose. Dies ist besonders häufig bei verschiedenen Sarkom- und hämatologischen Malignitätssubtypen, die diagnostisch durch das Vorhandensein spezifischer Fusionen definiert werden und/oder für die das Vorhandensein einer Fusion direkt die Prognose7,8 , 9 , 10 , 11. Dies sind nur einige Beispiele für die klinische Anwendung der Genfusionserkennung für Krebspatienten.
Aufgrund der entscheidenden Rolle bei der klinischen Entscheidungsfindung ist der genaue Genfusionsnachweis aus klinischen Proben von entscheidender Bedeutung. Zahlreiche Techniken wurden in klinischen Laboratorien für Fusions- oder chromosomale Umlagerungsanalysen eingesetzt, darunter: zytogenetische Techniken, Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Immunhistochemie (IHC) und 5’/3′ Expressionsungleichgewichtsanalyse (unter anderem)12,13,14,15. Derzeit hat die schnell wachsende Liste von umsetzbaren Genfusionen bei Krebs dazu geführt, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. Folglich werden einige traditionelle Techniken, die nur ein oder wenige Gene gleichzeitig abfragen können, zu ineffizienten Ansätzen, insbesondere wenn man bedenkt, dass klinische Tumorproben oft sehr endlich sind und nicht auf mehrere Assays aufgeteilt werden können. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist jedoch eine Analyseplattform, die sich gut für Multi-Gen-Tests eignet, und NGS-basierte Assays sind in klinischen molekulardiagnostischen Laboratorien üblich geworden.
Derzeit verwendete NGS-Assays für die Fusions-/Rearrangement-Erkennung variieren in Bezug auf das verwendete Eingabematerial, die für die Bibliotheksvorbereitung und Zielanreicherung eingesetzten Chemikalien und die Anzahl der Gene, die im Rahmen eines Tests abgefragt werden. NGS-Assays können auf RNA oder DNA (oder beidem) basieren, die aus der Probe extrahiert werden. Obwohl die RNA-basierte Analyse durch die Tendenz klinischer Proben behindert wird, stark degradierte RNA zu enthalten, umgeht sie die Notwendigkeit, große und oft sich wiederholende Introns zu sequenzieren, die das Ziel von DNA-basierten Fusionstests sind, sich aber für NGS als schwierig erwiesen haben. Datenanalyse16. Zielanreicherungsstrategien für RNA-basierte NGS-Assays lassen sich weitgehend in hybride Erfassung oder ampliconvermittelte Ansätze unterteilen. Während beide Strategien erfolgreich für die Fusionserkennung eingesetzt wurden, enthält jede von ihnen Vorteile gegenüber den anderen17,18. Hybride Erfassungsassays führen in der Regel zu komplexeren Bibliotheken und reduziertem Allelic-Aussetzer, während ampliconbasierte Assays im Allgemeinen weniger Input erfordern und zu weniger Off-Target-Sequenzierung19führen. Die primäre Einschränkung der traditionellen Amplikon-basierten Anreicherung ist jedoch vielleicht die Notwendigkeit von Primern für alle bekannten Fusionspartner. Dies ist problematisch, da viele klinisch wichtige Gene bekanntermaßen mit Dutzenden von verschiedenen Partnern verschmelzen, und selbst wenn das Primerdesign den Nachweis aller bekannten Partner erlaubt, blieben neuartige Fusionsereignisse unentdeckt. Eine kürzlich beschriebene Technik, die als verankerte Multiplex-PCR (kurz AMP) bezeichnet wird, behebt diese Einschränkung20. In AMP wird ein “halbfunktioneller” NGS-Adapter zu cDNA-Fragmenten ligiert, die aus Input-RNA abgeleitet werden. Die Zielanreicherung wird durch Verstärkung zwischen genspezifischen Primern und einem Primer am Adapter erreicht. Daher sollten alle Fusionen zu Genen von Interesse nachgewiesen werden, selbst wenn ein neuartiger Fusionspartner beteiligt ist (siehe Abbildung 1). Dieser Artikel beschreibt die Verwendung des ArcherDx FusionPlex Solid Tumor Kits, eines NGS-basierten Assays, der AMP für die Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung verwendet, zum Nachweis onkogener Genfusionen in soliden Tumorproben (siehe Ergänzende Tabelle 1 für vollständige Genliste). Das Wet-Bench-Protokoll und die Datenanalysewurden in einem CLIA-zertifizierten Labor (Clinical Laboratory Improvement Amendments) streng validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verankerte Multiplex-PCR-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von der Sequenzierung der nächsten Generation, eignet sich gut für die Multiplex-Genfusionsbewertung in klinischen Tumorproben. Durch die Konzentration auf DEN RNA-Eingang und nicht auf die genomische DNA wird die Notwendigkeit vermieden, große und sich wiederholende Introns zu sequenzieren. Da dieser Ansatz genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners verstärkt, werden neue Fusionen nachgewiesen. Dies ist ein kr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Molecular Pathology Shared Resource der University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) und vom Colorado Center for Personalized Medicine.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
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