アンカー多重ポリメラーゼ連鎖反応を用いた腫瘍性遺伝子融合検出、次世代シーケンシング
Summary
この記事では、アンカーされた多重ポリメラーゼ連鎖反応ベースのライブラリー調製キットの使用について詳しく述べたり、臨床固形腫瘍サンプルにおける発生遺伝子融合を評価するための次世代シーケンシングが続きます。ウェットベンチとデータ分析の両方の手順について説明します。
Abstract
遺伝子融合は、多くの異なるタイプの癌の発癌表現型にしばしば寄与する。さらに、癌患者からのサンプル中の特定の融合の存在は、多くの場合、診断、予後、および/または治療の選択に直接影響を与えます。その結果、遺伝子融合の正確な検出は、多くの疾患タイプの臨床管理の重要な構成要素となっています。最近まで、臨床遺伝子融合検出は、主に単一遺伝子アッセイの使用によって達成されました。しかし、臨床的意義を持つ遺伝子融合のリストが増え続けているために、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要性が生まれています。次世代シーケンシング(NGS)ベースのテストは、核酸を非常に平行な方法で配列する能力を通じて、この要求を満たしています。遺伝子標的濃縮に異なる戦略を採用した複数のNGSベースのアプローチが、それぞれ独自の長所と短所を持つ臨床分子診断で使用できるようになりました。本稿では、臨床固形腫瘍標本における遺伝子融合を評価するためにNGSに続くアンカー多重PCR(AMP)ベースの標的濃縮およびライブラリー調製の使用について説明する。AMPは、アンプリコンベースの濃縮アプローチの中でも、融合パートナーのアイデンティティにかかわらず遺伝子融合を識別するというユニークなアプローチです。ここでは、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出を保証するウェットベンチとデータ解析の両方の手順を詳しく説明します。
Introduction
2つ以上の遺伝子を単一の転写実体に融合させるのは、欠損、複製、挿入、反転、転座を含む大規模な染色体変動の結果として起こり得る。これらの融合遺伝子は、発現した遺伝子産物の転写制御および/または改変された機能特性を通じて、癌細胞1に発癌特性を付与することができる。多くの場合、融合遺伝子は、細胞増殖および生存経路を直接活性化することによって、主要な発癌因子として作用することが知られている。
がん患者に対する遺伝子融合の臨床的関連性は、フィラデルフィア染色体およびそれに対応するBCR-ABL1融合遺伝子の慢性骨髄性白血病(CML)2の発見によって最初に明らかになった。この融合遺伝子を特異的に標的とする低分子阻害剤イマチニブメシレートを開発し、BCR-ABL1-陽性CML患者3において顕著な有効性を実証した。 腫瘍遺伝子融合の治療的ターゲティングは固形腫瘍においても成功しており、非小細胞肺癌におけるALKおよびROS1融合遺伝子の阻害が主な例として役立つ4、5。最近、NTRK阻害剤ラロトレクチニブは、疾患部位6にかかわらず、NTRK1/2/3融合陽性固形腫瘍に対してFDA承認された。 治療の選択を超えて、遺伝子融合検出は疾患診断および予後にも役割を持つ。これは、特定の融合の存在によって診断的に定義される様々な肉腫および血液悪性腫瘍のサブタイプおよび/または融合の存在が予後を直接知らせる7,8で特に一般的である。,9,10歳,11.これらは、がん患者に対する遺伝子融合検出の臨床応用例のほんの一部にすぎない。
臨床意思決定において重要な役割を果たしているため、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出は極めて重要です。細胞遺伝学的手法、逆転写性ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、現場ハイブリダイゼーションにおける蛍光(FISH)を含む融合または染色体再配置分析のための臨床検査室で多数の技術が適用されている。免疫組織化学(IHC)、および5’/3’発現不均衡分析(とりわけ)12、13、14、15。現在、がんにおけるアクション可能な遺伝子融合のリストが急速に拡大している結果、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要が出てきました。その結果、一度に1つまたは少数の遺伝子しか照会できない伝統的な技術の中には、特に臨床腫瘍サンプルが非常に有限であり、複数のアッセイに分けられることが多いと考えると、非効率的なアプローチになりつつあります。しかし、次世代シーケンシング(NGS)は、多遺伝子検査に適した解析プラットフォームであり、NGSベースのアッセイは臨床分子診断ラボで一般的になっています。
現在使用されている核融合/再配置検出に使用されるNGSアッセイは、使用される入力材料、ライブラリー調製および標的濃縮に使用される化学物質、およびアッセイ内で照会された遺伝子の数に関して異なります。NGSアッセイは、試料から抽出されたRNAまたはDNA(またはその両方)に基づいていることができる。RNAベースの分析は、高度に分解されたRNAを含む臨床サンプルの傾向によって妨げられますが、DNAベースの融合試験の標的であるが、NGSでは困難であることが証明されている大規模で頻繁に反復的なイントロンを配列する必要性を回避します。データ分析16.RNAベースのNGSアッセイの標的濃縮戦略は、主にハイブリッド捕捉またはアンプリコン媒介アプローチに分けられます。両方の戦略は融合検出にうまく利用されていますが、それぞれが他の17、18に対する利点を含んでいます。ハイブリッドキャプチャアッセイは、一般的に、より複雑なライブラリと減少したアリルドロップアウトをもたらすのに対し、アンプリコンベースのアッセイは一般的に低い入力を必要とし、オフターゲットシーケンシング19の結果が少ない。しかし、おそらく、従来のアンプリコンベースの濃縮の主な制限は、すべての既知の融合パートナーへのプライマーの必要性です。多くの臨床的に重要な遺伝子が数十の異なるパートナーと融合することが知られており、たとえプリマー設計がすべての既知のパートナーの検出を可能にしたとしても、新しい融合事象は検出されないままであるので、これは問題となる。アンカー多重 PCR (または短い場合は AMP) と呼ばれる最近説明された手法は、この制限20に対処します。AMP では、入力 RNA から派生した cDNA フラグメントに「半機能」NGS アダプターがリゲーションされます。標的濃縮は、遺伝子特異的プライマーとアダプターへのプライマーとの間の増幅によって達成される。その結果、目的の遺伝子に対するすべての融合は、たとえ新しい融合パートナーが関与していても、検出されるべきである(図1参照)。この記事では、固形腫瘍サンプルにおける発因性遺伝子融合の検出にAMPを採用したNGSベースのアッセイであるArcherDx FusionPlex固形腫瘍キットの使用について説明します(補足表1参照)完全な遺伝子リスト)。ウェットベンチプロトコルとデータ分析手順は、臨床検査改善修正(CLIA)認定ラボで厳密に検証されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
アンカー多重PCRベースの標的濃縮およびライブラリー調製に続いて次世代シーケンシングは、臨床腫瘍サンプルにおける多重遺伝子融合評価に適しています。ゲノムDNAではなくRNA入力に焦点を当てることで、大きく反復的なイントロンを配列する必要性が回避されます。さらに、このアプローチは、融合パートナーの同一性にかかわらず遺伝子融合を増幅するため、新規の融合が検出される?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、コロラド大学の分子病理学共有リソース(国立がん研究所がんセンター支援助成金第1号)によって支援されました。P30-CA046934)とコロラド州パーソナライズド医療センターによって。
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
