앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석
Summary
이 기사에서는 임상 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합을 평가하기 위해 차세대 염기서열 분석 뒤에 앵커된 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 기반 라이브러리 준비 키트의 사용을 자세히 설명합니다. 습식 벤치 와 데이터 분석 단계가 모두 설명되어 있습니다.
Abstract
유전자 융합은 많은 다른 유형의 암의 종양 발생 표현형에 자주 기여합니다. 추가적으로, 암 환자에게서 견본에 있는 특정 융합의 존재는 수시로 진단, 예후 및/또는 치료 선택에 직접적인 영향을 미칩니다. 그 결과, 유전자 융합의 정확한 검출은 많은 질병 유형에 대한 임상 관리의 중요한 구성 요소가되었습니다. 최근까지, 임상 유전자 융합 검출은 주로 단일 유전자 검법의 사용을 통해 달성되었다. 그러나, 임상 중요성을 가진 유전자 융합의 계속 증가하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가하기위한 필요성을 만들었습니다. 차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 테스트는 핵산을 대규모 병렬 방식으로 서열화하는 능력을 통해 이러한 요구를 충족시켰습니다. 유전자 표적 농축을 위한 다른 전략을 채택하는 다중 NGS 기지를 둔 접근은 지금 그것의 자신의 강점 및 약점을 가진 임상 분자 진단에서 사용하기 위하여 유효합니다. 이 논문은 임상 고형 종양 표본에서 유전자 융합을 평가하기 위해 NGS에 이어 앵커된 멀티플렉스 PCR(AMP) 기반 표적 농축 및 라이브러리 제제의 사용을 설명합니다. AMP는 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 식별한다는 점에서 앰플리콘 기반 농축 접근법 중에서 독특합니다. 여기에 상세한 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출을 보장하는 습식 벤치 및 데이터 분석 단계 모두있습니다.
Introduction
단일 전사 엔티티로 2개 이상의 유전자의 융합은 삭제, 복제, 삽입, 반전 및 전좌를 포함한 대규모 염색체 변이의 결과로 발생할 수 있다. 발현된 유전자 생성물의 변질된 전사 제어 및/또는 변경된 기능적 특성을 통해, 이러한 융합 유전자는 암세포에 종양발생 특성을 부여할 수 있다1. 많은 경우에, 융합 유전자는 세포 증식 및 생존 경로를 직접 활성화하여 1 차적인 종양 발생 드라이버로 작용하는 것으로 알려져 있습니다.
암 환자를 위한 유전자 융합의 임상 적 관련성은 먼저 만성 골수성 백혈병 (CML)에서 필라델피아 염색체 및 상응하는 BCR-ABL1 융합 유전자의 발견으로 명백해졌습니다 2. 소분자 억제제 imatinib mesylate는 이러한 융합 유전자를 구체적으로 표적으로 하기 위해 개발되었으며 BCR-ABL1-양성CML 환자3에서현저한 효능을 입증하였다. 종양발생 유전자 융합의 치료적 표적화는 또한 고형 종양에서 성공하였고, 비소세포 폐암에서 ALK 및 ROS1 융합 유전자의 억제가 1차 적인 예로 4,5를수행하고 있다. 최근, NTRK 억제제 라로트렉티닙은 질병 부위 6에 관계없이 NTRK1/2/3 융합양성 고형 종양에 대한 FDA 승인을 받았다. 치료 선택을 넘어, 유전자 융합 검출은 또한 질병 진단 및 예후에서 역할이 있습니다. 이것은 특정 융합의 존재에 의해 진단적으로 정의되는 각종 육종 및 혈액학 악성 아류형에서 특히 널리 퍼져 있고/또는 융합의존재가 예후7,8을 직접 알려줍니다 , 9개 , 10개 , 11.이들은 암 환자를 위한 유전자 융합 검출의 임상 적용의 예에 불과하다.
임상 의사 결정에 중요한 역할을 하기 때문에 임상 샘플에서 정확한 유전자 융합 검출이 매우 중요합니다. 세포유전학 기술, 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 신계 혼성화(FISH) 형광 등 융합 또는 염색체 재배열 분석을 위한 임상 실험실에 수많은 기술이 적용되었습니다. 면역막이화학(IHC) 및 5’/3′ 발현 불균형 분석(그 외)12,13,14,15. 현재, 암에 있는 실행 가능한 유전자 융합의 급속하게 팽창하는 목록은 동시에 다중 유전자의 융합 상태를 평가할 필요 귀착되었습니다. 따라서, 한 번에 하나 또는 몇 개의 유전자만 쿼리할 수 있는 몇몇 전통적인 기술은 비효율적인 접근이 되고 있습니다, 특히 임상 종양 견본이 수시로 아주 유한하고 몇몇 분석실험 사이에서 분할되는 것을 허용되지 않다는 것을 고려할 때. 그러나 차세대 염기서열 분석(NGS)은 다중 유전자 검사에 적합한 분석 플랫폼이며 NGS 기반 분석실험은 임상 분자 진단 실험실에서 일반화되고 있습니다.
융합/재배열 검출을 위해 현재 사용되는 NGS 분석제는 사용된 입력 물자, 도서관 준비 및 표적 농축을 위해 채택된 화학, 및 분석분석내에서 질의된 유전자의 수에 관하여 변화합니다. NGS 검소는 샘플로부터 추출된 RNA 또는 DNA(또는 둘 다)에 기초할 수 있다. RNA 기지를 둔 분석은 높게 저하된 RNA를 포함하는 임상 견본의 경향에 의해 방해되더라도, DNA 기지를 둔 융합 시험의 표적이 고 수시로 반복적인 인트론을 순서를 정하는 필요를 우회합니다 그러나 NGS를 위해 어려운 것으로 입증되었습니다 데이터 분석16. RNA 기반 NGS 공소시에 대한 표적 농축 전략은 크게 하이브리드 포획 또는 앰플리콘 매개 접근법으로 나눌 수 있다. 두 전략이 융합 검출에 성공적으로 활용되었지만 각각 다른17,18에비해 장점이 있습니다. 하이브리드 포획 분석법은 일반적으로 더 복잡한 라이브러리를 초래하고 대립계 탈락을 감소시키는 반면, 앰플리코 기반 분석법은 일반적으로낮은 입력을 필요로 하고 오프 타겟 시퀀싱이 적은 19를 초래한다. 그러나, 아마도 전통적인 amplicon 기반 농축의 주요 제한은 모든 알려진 된 융합 파트너에 프라이머에 대 한 필요성. 이것은 많은 임상적으로 중요한 유전자가 다른 파트너의 수십와 융합하기 위하여 알려지고 있기 때문에 문제가 되고, 프라이머 디자인이 모든 알려진 파트너의 탐지를 위해 허용되더라도, 새로운 융합 사건은 검출되지 않는 남아 있을 것입니다. 최근에 설명한 기술은 앵커드 멀티플렉스 PCR(또는 짧게 AMP)을 지칭하여 이 제한20을해결한다. AMP에서, ‘반 기능’ NGS 어댑터는 입력 RNA에서 파생되는 cDNA 단편에 결찰된다. 표적 농축은 유전자 특이프라이머와 어댑터에 대한 프라이머 사이의 증폭에 의해 달성된다. 그 결과, 관심 있는 유전자에 대한 모든 융합이 새로운 융합 파트너가 관여하더라도 검출되어야 한다(도 1참조). 이 문서에서는 고형 종양 샘플에서 종양 발생 유전자 융합의 검출을 위해 표적 농축 및 라이브러리 준비를 위해 AMP를 사용하는 NGS 기반 분석인 ArcherDx FusionPlex 고형 종양 키트의 사용에 대해 설명합니다(보충 표 1 전체 유전자 목록)을 참조하십시오. 습식 벤치 프로토콜 및 데이터 분석 단계는 임상 실험실 개선 수정안(CLIA) 인증 실험실에서 엄격하게 검증되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고정된 멀티플렉스 PCR 기반 표적 농축 및 라이브러리 준비와 차세대 염기서열 분석이 임상 종양 샘플에서 다중유전자 융합 평가에 적합합니다. 게놈 DNA보다는 RNA 입력에 집중함으로써, 크고 반복적인 인트론을 서열화할 필요가 회피됩니다. 추가적으로, 이 접근은 융합 파트너의 정체성에 관계없이 유전자 융합을 증폭하기 때문에, 새로운 융합은 검출됩니다. 이는 임상 영역에서 중요한 이점이며,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 콜로라도 대학의 분자 병리학 공유 자원에 의해 지원되었다 (국립 암 연구소 암 센터 지원 보조금 번호. P30-CA046934) 및 개인 의학콜로라도 센터에 의해.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
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