Detección de fusión genética oncogénica mediante reacción en cadena de polimerasa múltiplex anclada seguida de secuenciación de próxima generación
Summary
Este artículo detalla el uso de un kit de preparación de biblioteca sin reacción en cadena de múltiples polimerasas anclada seguido de secuenciación de próxima generación para evaluar las fusiones de genes oncogénicos en muestras de tumores sólidos clínicos clínicos. Se describen los pasos de análisis de datos y de banco húmedo.
Abstract
Las fusiones genéticas con frecuencia contribuyen al fenotipo oncogénico de muchos tipos diferentes de cáncer. Además, la presencia de ciertas fusiones en muestras de pacientes con cáncer a menudo influye directamente en el diagnóstico, pronóstico y/o selección de terapia. Como resultado, la detección precisa de fusiones genéticas se ha convertido en un componente crítico del manejo clínico para muchos tipos de enfermedades. Hasta hace poco, la detección de la fusión génica clínica se realizaba predominantemente mediante el uso de ensayos de un solo gen. Sin embargo, la lista cada vez mayor de fusiones genéticas con importancia clínica ha creado la necesidad de evaluar el estado de fusión de múltiples genes simultáneamente. Las pruebas basadas en secuenciación de próxima generación (NGS) han satisfecho esta demanda a través de la capacidad de secuenciar ácido nucleico de manera masivamente paralela. Múltiples enfoques basados en NGS que emplean diferentes estrategias para el enriquecimiento de objetivos genéticos ahora están disponibles para su uso en diagnóstico molecular clínico, cada uno con sus propias fortalezas y debilidades. Este artículo describe el uso de el enriquecimiento objetivo basado en PCR múltiple (AMP) anclado y la preparación de bibliotecas seguida de NGS para evaluar las fusiones genéticas en muestras de tumores sólidos clínicos. AMP es único entre los enfoques de enriquecimiento basados en amplificación, ya que identifica fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión. Aquí se detallan los pasos de análisis de datos y de banco húmedo que garantizan una detección precisa de la fusión genética a partir de muestras clínicas.
Introduction
La fusión de dos o más genes en una sola entidad transcripcional puede ocurrir como resultado de variaciones cromosómicas a gran escala, incluyendo eliminaciones, duplicaciones, inserciones, inversiones y translocaciones. A través del control transcripcional alterado y/o las propiedades funcionales alteradas del producto genético expresado, estos genes de fusión pueden conferir propiedades oncogénicas a las células cancerosas1. En muchos casos, los genes de fusión son conocidos por actuar como principales motores oncogénicos mediante la activación directa de la proliferación celular y las vías de supervivencia.
La relevancia clínica de las fusiones genéticas para los pacientes con cáncer se hizo evidente por primera vez con el descubrimiento del cromosoma Filadelfia y el gen de fusión BCR-ABL1 correspondiente en la leucemia mielógena crónica (LMC)2. El inhibidor de molécula pequeña imatinib mesilato fue desarrollado para apuntar específicamente a este gen de fusión y demostró una eficacia notable en pacientes con LMC BCR-ABL13. La segmentación terapéutica de fusiones genéticas oncogénicas también ha tenido éxito en tumores sólidos, con la inhibición de los genes de fusión ALK y ROS1 en el cáncer de pulmón de células no pequeñas que sirven como ejemplos primarios4,5. Recientemente, el inhibidor de la NTRK larotrectinib fue aprobado por la FDA para tumores sólidos positivos de fusión NTRK1/2/3, independientemente del sitiodela enfermedad 6. Más allá de la selección de la terapia, la detección de la fusión génica también tiene roles en el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Esto es particularmente frecuente en varios subtipos de sarcoma y neoplasia maligna hematológica que se definen diagnósticamente por la presencia de fusiones específicas y/o para las que la presencia de una fusión informa directamente al pronóstico7,8 , 9 , 10 , 11. Estos son sólo algunos de los ejemplos de la aplicación clínica de la detección de fusión génica para pacientes con cáncer.
Debido al papel crítico en la toma de decisiones clínicas, la detección precisa de la fusión genética a partir de muestras clínicas es de vital importancia. Se han aplicado numerosas técnicas en laboratorios clínicos para análisis de fusión o reordenamiento cromosómico, incluyendo: técnicas citogenéticas, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), hibridación flúor in situ (FISH), inmunohistoquímica (IHC), y 5’/3′ análisis de desequilibrio de expresión (entre otros)12,13,14,15. En la actualidad, la lista de fusiones genéticas procesables en el cáncer, que se está expandiendo rápidamente, ha dado lugar a la necesidad de evaluar simultáneamente el estado de fusión de múltiples genes. En consecuencia, algunas técnicas tradicionales que sólo pueden consultar uno o unos pocos genes a la vez se están convirtiendo en enfoques ineficientes, especialmente si se tiene en cuenta que las muestras de tumores clínicos son a menudo muy finitas y no son susceptibles de ser divididas entre varios ensayos. La secuenciación de próxima generación (NGS), sin embargo, es una plataforma de análisis que es adecuada para pruebas multigenicas, y los ensayos basados en NGS se han vuelto comunes en los laboratorios de diagnóstico molecular clínico.
Los ensayos NGS utilizados actualmente para la detección de fusión/reorganización varían en lo que respecta al material de entrada utilizado, las químicas empleadas para la preparación de bibliotecas y el enriquecimiento objetivo, y el número de genes consultados dentro de un ensayo. Los ensayos NGS pueden basarse en ARN o ADN (o ambos) extraídos de la muestra. Aunque el análisis basado en ARN se ve obstaculizado por la tendencia de las muestras clínicas a contener ARN altamente degradado, elude la necesidad de secuenciar intrones grandes y a menudo repetitivos que son los objetivos de las pruebas de fusión basadas en ADN, pero que han demostrado ser difíciles para el NGS análisis de datos16. Las estrategias de enriquecimiento objetivo para ensayos NGS basados en ARN se pueden dividir en gran medida en métodos híbridos de captura o de amplificación. Mientras que ambas estrategias se han utilizado con éxito para la detección de fusión, cada una contiene ventajas sobre el otro17,18. Los ensayos híbridos de captura generalmente dan como resultado bibliotecas más complejas y reducción de la caída alélica, mientras que los ensayos basados en amplificación generalmente requieren una entrada más baja y dan como resultado una secuencia menos dedestino19. Sin embargo, tal vez la principal limitación del enriquecimiento tradicional basado en amplicones sea la necesidad de imprimación para todos los socios de fusión conocidos. Esto es problemático ya que se sabe que muchos genes clínicamente importantes se fusionan con docenas de socios diferentes, e incluso si el diseño de imprimación permitiera la detección de todos los socios conocidos, nuevos eventos de fusión permanecerían sin ser detectados. Una técnica recientemente descrita denominada PCR múltiplex anclado (o AMP para abreviar) aborda esta limitación20. En AMP, un adaptador NGS “medio funcional” se liga a fragmentos de ADNc que se derivan del ARN de entrada. El enriquecimiento objetivo se logra mediante la amplificación entre imprimaciones específicas genéticas y una imprimación al adaptador. Como resultado, deben detectarse todas las fusiones con genes de interés, incluso si se trata de un nuevo compañero de fusión (ver Figura 1). Este artículo describe el uso del kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un ensayo basado en NGS que emplea AMP para el enriquecimiento objetivo y la preparación de bibliotecas, para la detección de fusiones genéticas oncogénicas en muestras de tumores sólidos (ver Tabla Suplementaria 1 para lista completa de genes). El protocolo de banco húmedo y los pasos de análisis de datos han sido rigurosamente validados en un laboratorio certificado por Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA).
Protocol
Representative Results
Discussion
El enriquecimiento objetivo y la preparación de bibliotecas basados en PCR múltiples anclados seguidos de secuenciación de próxima generación son adecuados para la evaluación de la fusión genética multiplexada en muestras de tumores clínicos. Al centrarse en la entrada de ARN en lugar del ADN genómico, se evita la necesidad de secuenciar intrones grandes y repetitivos. Además, dado que este enfoque amplifica las fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión, se detectan nuevas fus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Recurso Compartido de Patología Molecular de la Universidad de Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) y por el Centro Colorado de Medicina Personalizada.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
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