Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti
Summary
Bu makalede, klinik katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions değerlendirmek için yeni nesil sıralamanın ardından bir bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyon tabanlı kitaplık hazırlama kiti kullanımını ayrıntılarıyla. Hem ıslak tezgah hem de veri analizi adımları açıklanmıştır.
Abstract
Gen Fusions sıklıkla kanser birçok farklı türde Onkojenik fenotipi katkıda bulunur. Ayrıca, kanser hastalarından numunelerde belirli Fusions varlığı genellikle doğrudan tanı etkiler, prognoz, ve/veya tedavi seçimi. Sonuç olarak, gen Fusions doğru tespiti birçok hastalık türleri için klinik yönetim kritik bir bileşeni haline gelmiştir. Yakın zamana kadar, klinik gen füzyon algılama ağırlıklı olarak tek gen assays kullanımı ile gerçekleştiriliyordu. Ancak, klinik öneme sahip gen Fusions sürekli büyüyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için bir ihtiyaç yarattı. Yeni nesil sıralama (NGS) tabanlı testler, kitlesel paralel moda nüklik asit sırası yeteneği ile bu talebi karşılamıştır. Gen hedef zenginleştirme için farklı stratejiler kullanan birden fazla NGS tabanlı yaklaşımlar artık her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerini içeren klinik moleküler diagnostikte kullanılabilir. Bu makalede, bağlantılı Multiplex PCR (AMP) tabanlı hedef zenginleştirme ve kütüphanenin hazırlanması, klinik katı tümör örneklerinde gen Fusions değerlendirmek için NGS tarafından izlenen kullanılır. AMP, Fusion ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions ‘i tanımladığı için Amplicon tabanlı zenginleştirme yaklaşımlarının arasında benzersizdir. Burada ayrıntılı olarak klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti sağlayan ıslak tezgah ve veri analizi adımları bulunmaktadır.
Introduction
İki veya daha fazla genin tek bir transkripsiyon varlığı içine birleşmeleri, silmeler, yinelemeler, eklemeler, inversions ve translocations dahil olmak üzere büyük ölçekli kromozomal varyasyonların sonucu olarak ortaya çıkabilir. Değiştirilmiş transkripsiyonel kontrol ve/veya ifade gen ürünün fonksiyonel özellikleri değiştirilmiş sayesinde, bu füzyon genler kanser hücrelerine Onkojenik özellikleri görüşmek olabilir1. Birçok durumda, Fusion genler doğrudan hücresel proliferasyon ve hayatta kalma yollarını aktive ederek primer Onkojenik sürücüler olarak hareket bilinmektedir.
Kanser hastaları için gen Fusions klinik alaka ilk Philadelphia kromozom ve karşılık gelen BCR-ABL1 Fusion gen kronik Miyelojen lösemi (KML)2keşfi ile belirgin oldu. Küçük molekül inhibitörü İmatinib Mesilat özellikle bu füzyon geni hedef ve BCR-ABL1-pozitif KML hastalarda dikkat çekici etkinliği göstermiştir geliştirilmiştir3. Onkojenik gen Fusions terapötik hedefleme de katı tümörlerde başarılı olmuştur, alk ve ROS1 Fusion genleri temel örnekler olarak hizmet veren küçük hücreli olmayan akciğer kanseri inhibisyonu ile4,5. Son zamanlarda, NTRK inhibitörü larotrectinib FDA onaylı NTRK1/2/3 Fusion-pozitif katı tümörlerin, ne olursa olsun hastalık site6. Terapi seçimlerinin ötesinde, gen füzyon tespiti de hastalık tanısı ve prognoz rolleri vardır. Bu özellikle belirli Fusions ve/veya bir füzyon varlığı doğrudan prognoz bilgilendirir tarafından tanımlanan çeşitli sarkomu ve hematolojik malignite alt türleri yaygındır7,8 , 9 , 10 ‘ dan fazla , 11. Bunlar ancak kanser hastaları için gen füzyon algılama klinik uygulama örneklerinden birkaçı.
Klinik karar verme konusunda kritik rol oynadığı için klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti hayati önem taşımaktadır. Klinik laboratuvarlarda, sitogenetik teknikler, Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), floresans in situ hibridizasyon (balık) gibi füzyon veya kromozomal yeniden düzenleme analizi için çok sayıda teknik uygulandı. immünhistokimya (IHC) ve 5 ‘/3 ‘ ifade dengesizliği Analizi (diğerleri arasında)12,13,14,15. Şu anda, kanserde harekete geçirilebilir gen Fusions hızla genişleyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için ihtiyaç sonuçlandı. Sonuç olarak, bir defada sadece bir veya birkaç geni sorgulayabilir bazı geleneksel teknikler verimsiz yaklaşımlar haline gelmektedir, özellikle de klinik tümör örneklerinin genellikle çok sonlu olduğunu ve çeşitli bulguların arasına bölünmeye imkan olmadığını düşünürsek. Ancak yeni nesil sıralama (NGS), çok gen testi için uygun bir analiz platformudur ve NGS tabanlı testler klinik Moleküler diagnostik laboratuvarlarda yaygın hale gelmiştir.
Şu anda kullanılmış NGS Fusion/yeniden düzenleme algılama için kullanılan giriş malzemesi, Kütüphane hazırlama ve hedef zenginleştirme için kullanılan kimyaları ve bir tahlil içinde sorgulanan genlerin sayısı açısından değişir. NGS Analizör, örnekten çıkarılan RNA veya DNA (ya da her ikisi) temelinde olabilir. RNA tabanlı analiz, klinik numunelerin son derece bozulmuş RNA içermesine eğiliminden kaçınmasına karşın, DNA tabanlı füzyon testinin hedefleri olan ama NGS için zor olduğu kanıtlanmış büyük ve sık tekrarlayan intronlar sıralama ihtiyacını aşmaktadır. Veri Analizi16. RNA tabanlı NGS uygulamaları için hedef zenginleştirme stratejileri büyük ölçüde hibrit yakalama veya Amplicon-aracılı yaklaşımlara bölünebilir. Fusion algılama için her iki strateji de başarıyla kullanılırken, her biri diğer17,18üzerinde avantajları içerir. Hibrid yakalama genellikle daha karmaşık kütüphaneler ve azaltılmış allelik bırakma sonucu, Amplicon tabanlı asder genellikle daha düşük giriş gerektirir ve daha az hedef sıralı19sonuç sağlar. Ancak, belki de geleneksel Amplicon tabanlı zenginleştirme birincil sınırlama tüm bilinen Fusion ortakları için astar gerekir. Birçok klinik olarak önemli genlerin düzinelerce farklı ortakla sigortalı olduğu bilinmektedir ve primer tasarım tüm bilinen ortakların algılanması için izin verilse bile, yeni füzyon etkinlikleri tespit edilmedi. Son zamanlarda tarif edilen teknik, bu sınırlama20‘ de (veya kısa amp) bağlantılı MULTIPLEX PCR olarak adlandırılır. AMP ‘de, ‘ yarı işlevsel ‘ NGS bağdaştırıcısı, giriş RNA ‘dan türetilen cDNA parçalarıyla bağlanıyor. Hedef zenginleştirme, gen spesifik astar ve adaptör için bir astar arasındaki amplifikasyon ile elde edilir. Sonuç olarak, bir yeni füzyon ortağı dahil olsa bile, ilgi genler için tüm Fusions, tespit edilmelidir (bkz. Şekil 1). Bu makalede ArcherDx FusionPlex katı tümör kiti kullanımı, bir NGS tabanlı tahlil, hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlama için AMP istihdam, katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions tespiti için (bkz: Tamamlayıcı Tablo 1 için tam gen listesi). Islak tezgah Protokolü ve veri analizi adımları, klinik laboratuar Iyileştirme değişiklikleri (CLIA) sertifikalı bir laboratuvarda titizlikle onaylanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağlantılı Multiplex PCR tabanlı hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlığı yeni nesil sıralamanın ardından, klinik tümör örneklerinde Multiplexed gen Fusion değerlendirmesi için de uygundur. Genomik DNA yerine RNA girişine odaklanarak, büyük ve tekrarlayan intron dizilme ihtiyacı kaçınılmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım füzyon ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions güçlendiriyor, yeni Fusions algılanır. Bu klinik alanda kritik bir avantajdır ve literatürde bildirilen amp ara…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Colorado Üniversitesi Moleküler patoloji paylaşımlı kaynak tarafından destekleniyordu (Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Grant No. P30-CA046934) ve Colorado Merkezi tarafından Kişiselleştirilmiş tıp.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
