Onkogen Gene fusion detektion med förankrade multiplex Polymerase kedjereaktion följt av nästa generations sekvensering
Summary
Denna artikel specificerar användningen av en förankrad multiplex polymeras kedjereaktion-baserade bibliotek förberedelse kit följt av nästa generations sekvensering för att bedöma för onkogena gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. Både våt-bänk och dataanalys steg beskrivs.
Abstract
Gen fusioner bidrar ofta till den onkogena fenotypen hos många olika typer av cancer. Dessutom, närvaron av vissa fusioner i prover från cancerpatienter ofta direkt påverkar diagnos, prognos, och/eller terapi urval. Som ett resultat har korrekt detektion av gen fusioner blivit en kritisk komponent i klinisk hantering för många sjukdomstyper. Tills nyligen, klinisk gen fusion upptäckt var främst åstadkommas genom användning av engenstester. Den ständigt växande förteckningen över gen fusioner med klinisk betydelse har dock skapat ett behov av att bedöma fusions status för flera gener samtidigt. Nästa generations sekvensering (NGS)-baserad testning har uppfyllt denna efterfrågan genom förmågan att sekvensera nukleinsyra i massivt parallella sätt. Flera NGS-baserade metoder som använder olika strategier för gentarget berikning är nu tillgängliga för användning i klinisk molekylär diagnostik, var och en med sina egna styrkor och svagheter. Denna artikel beskriver användningen av förankrade Multiplex PCR (AMP)-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av NGS att bedöma för gen fusioner i kliniska fasta tumörprover. AMP är unik bland amplicon-baserade berikningsmetoder genom att den identifierar gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern. Detaljerade här är både våt-bänk och dataanalys steg som säkerställer korrekt gen fusion upptäckt från kliniska prover.
Introduction
Fusion av två eller flera gener till en enda transkriptionell enhet kan inträffa som ett resultat av storskaliga kromosomala variationer inklusive borttagningar, dubbleringar, infogningar, inversioner och translokationer. Genom förändrad transkriptionell kontroll och/eller förändrade funktionella egenskaper hos den uttryckta genprodukten kan dessa fusions gener ge onkogena egenskaper till cancerceller1. I många fall är fusions gener kända för att fungera som primära onkogena förare genom att direkt aktivera cellulär proliferation och överlevnads vägar.
Den kliniska relevansen av gen fusioner för cancerpatienter blev först uppenbar med upptäckten av Philadelphia-kromosomen och motsvarande BCR-ABL1 fusions gen vid kronisk myelogen leukemi (KML)2. Den lilla molekyl hämmaren imatinib mesylate utvecklades för att specifikt rikta in sig på denna fusions gen och uppvisade anmärkningsvärd effekt hos BCR-ABL1-positiva KML-patienter3. Terapeutisk inriktning av onkogena gen fusioner har också varit framgångsrik i solida tumörer, med hämning av ALK och ROS1 fusion gener i icke-småcellig lungcancer som fungerar som primära exempel4,5. Nyligen, den NTRK inhibitor larotrectinib var FDA godkänt för NTRK1/2/3 fusion-positiva solida tumörer, oavsett sjukdoms plats6. Utöver terapi val, gen fusion upptäckt har också roller i sjukdomsdiagnos och prognos. Detta är särskilt utbredd i olika sarkom och hematologiska malignitet subtyper som är diagnostiskt definieras av närvaron av specifika fusioner och/eller för vilka förekomst av en fusion direkt informerar prognosen7,8 , 9 , 10 , 11. Detta är bara några exempel på klinisk tillämpning av detektion av gen fusion för cancerpatienter.
På grund av den kritiska roll i kliniskt beslutsfattande, noggrann gen fusion detektion från kliniska prover är av avgörande betydelse. Många tekniker har tillämpats i kliniska laboratorier för fusion eller kromosom rearrangering analys inklusive: cytogenetiska tekniker, omvänd Transkription polymeras kedjereaktion (RT-PCR), fluorescens in situ hybridisering (fisk), immunohistokemi (IHC), och 5 ‘/3 ‘ Expression obalans analys (bland annat)12,13,14,15. För närvarande, den snabbt växande lista över angripbara gen fusioner i cancer har resulterat i behovet av att bedöma fusions status av flera gener samtidigt. Följaktligen, vissa traditionella tekniker som bara kan fråga en eller några gener i taget blir ineffektiva metoder, särskilt när man överväger att kliniska tumör prover är ofta mycket ändlig och inte mottagliga för att delas upp bland flera analyser. Nästa generations sekvensering (NGS) är dock en analysplattform som lämpar sig väl för flergenstester, och NGS-baserade analyser har blivit vanliga i laboratorier för klinisk molekylär diagnostik.
För närvarande används NGS analyser för fusion/rearrangering upptäckt varierar med avseende på använt material, kemiska sammansättningar som används för bibliotek beredning och mål berikning, och antalet gener tillfrågade inom en analys. NGS-analyser kan baseras på RNA eller DNA (eller båda) som utvinns ur provet. Även om RNA-baserad analys hämmas av tendensen hos kliniska prover att innehålla kraftigt försämrad RNA, kringgår det behovet av att sekvensera stora och ofta repetitiva introner som är målen för DNA-baserade fusions test men har visat sig vara svåra för NGS dataanalys16. Mål beriknings strategier för RNA-baserade NGS-analyser kan till stor del delas in i hybrid fångst eller amplicon-medierade metoder. Även om båda strategierna framgångsrikt har utnyttjats för fusion Detection, varje innehåller fördelar jämfört med de andra17,18. Hybrid Capture-analyser resulterar i allmänhet i mer komplexa bibliotek och minskad alleliska dropout, medan amplicon-baserade analyser i allmänhet kräver lägre indata och resulterar i mindre off-Target-sekvensering19. Men kanske den primära begränsningen av traditionella amplicon-baserade berikning är behovet av primers till alla kända fusion partners. Detta är problematiskt eftersom många kliniskt viktiga gener är kända för att smälta samman med dussintals olika partners, och även om primer design tillåts för detektering av alla kända partners, nya fusion händelser skulle förbli oupptäckta. En nyligen beskrivna teknik kallas förankrade Multiplex PCR (eller AMP för kort) adresser denna begränsning20. I amp är en halv funktionell ngs-adapter och ligaturer till cDNA-fragment som härleds från ingångsrna. Mål berikningen uppnås genom amplifiering mellan genspecifika primers och en primer till adaptern. Som ett resultat av detta bör alla fusioner till gener av intresse, även om en ny fusion partner berörs, upptäckas (se figur 1). Denna artikel beskriver användningen av ArcherDx FusionPlex solid tumör kit, en NGS-baserad analys som sysselsätter AMP för mål berikning och bibliotek förberedelse, för detektion av onkogen gen fusioner i fasta tumörprover (se kompletterande tabell 1 för fullständiga gen listan). Wet-Bench protokoll och dataanalys steg har noggrant validerats i en klinisk laboratorie förbättring ändringar (CLIA)-certifierade laboratorium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förankrade Multiplex PCR-baserade mål berikning och bibliotek förberedelse följt av nästa generations sekvensering är väl lämpad för multiplexade Gene fusion bedömning i kliniska tumörprover. Genom att fokusera på RNA-indata i stället för genomiskt DNA undviks behovet av att sekvensera stora och repetitiva introner. Eftersom detta tillvägagångssätt förstärker gen fusioner oavsett identiteten hos fusions partnern upptäcks nya fusioner. Detta är en kritisk fördel i den kliniska sfären, och det har f?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den molekylära patologi delade resursen vid University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center support Grant No. P30-CA046934) och Colorado Center för personlig medicin.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
Referências
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
