מחקר זה מתאר לחות קלאסית באמצעות שיטת הסרט דק השומנים לקראת nanoliposome סוימים ואחריו ננו-חלקיק אפיון. 47 kDa-hydrophilic וחלבון כדורי, טארין, הוא כיום בהצלחה כאסטרטגיה כדי לשפר את היציבות, להימנע הרשאה מהירה, ולקדם שחרור מבוקר. ניתן להתאים את השיטה לעטיפת מולקולות הידרופובי.
ליפוכמה nanocapsules הוחלו למטרות רבות בתעשיית התרופות, קוסמטיקה, ומזון. תכונות של ליפוזומים כוללים תאימות ביולוגית שלהם, biodegradability, לא חיסוני, חוסר רעילות, ויכולת להוסיף גם תרכובות הידרופיפילית והידרו-פוביות. הידרציה הקלאסית של סרטי השומנים הדק בממס אורגני מיושם כאן כטכניקה לכמס טארין, לקטין צמח, ב nanoliposomes. Nanoliposome גודל, יציבות, מלכודת יעילות, ואפיון מורפולוגית מתוארים בפרוטרוט. הננו-פוטזומים מוכנים באמצעות 1, 2-dioleoyl-sn-גליצרול-3-פוספולאטאנאמין (סם), 1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פוספהואנתאנאואמין-N-[אמינו (פוליאתילן גליקול)-2000] (אמוניום מלח; DSPE-MPEG 2000), ו cholesterylhemisuccinate (CHEMS) כמו המרכיבים העיקריים. שומנים מומס הראשון ב כלורופורם כדי להשיג סרט השומנים דק כי הוא הנוזלים לאחר מכן בתמיסה אמוניום גופרתי המכיל את החלבון להיות לכוד ומודבטים לילה. לאחר מכן, טכניקות sonication ושחול מוחלים כדי ליצור unilamellar שלפוחיות ננו-בינוניות. המדד הגדול והרב של הננו-שלפוחית נקבעים על ידי פיזור אור דינמי, ואילו מורפולוגיה ננו-שלפוחית מוערך על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני. יעילות מלכודת נקבעת על ידי היחס של כמות החלבון שאינו כימוס לכמות המקורית של חלבון טעון בתחילה. ליפוזומים הומוגנית מתקבלים בגודל ממוצע של 155 ננומטר וערך המדד של 0.168. יעילות מלכודת גבוהה של 83% מושגת.
מספר המחקרים היעילים העלו בשנים האחרונות את מערכות אספקת הסמים היעילות. עם זאת, מגבלות כגון הסיווג מהיר, ביולוגי עני התפלגות, מסיסות ב-pH פיזיולוגי וספיגת הסלולר מספיק עדיין צריך להיות מעל. השימוש במערכות ננו התפתחה כהתקדמות האחרונה בסרטן therapeutics, להחיל כדי להגדיל את הריכוז התאיים של תרופות בתוך תאים סרטניים תוך מזעור רעילות בתאים בריאים. יתר על כן, חלקיקים שהתקבלו ממגוון שונים של חומרים (כלומר, פולימרים, דנדריטים, ליפוזומים, וירוסים, פחמן צינוריות, ומתכות כגון תחמוצת ברזל וזהב) מוחלים כרגע כדי לשפר את ההשפעות נגד סרטן ולהפחית מערכתי רעילות1. ליפוכמה nanocapsules בפרט הוחלו למטרות רבות בתעשיית התרופות, קוסמטיקה, ומזון. בשנים האחרונות, מוצרים נוטראטיים שונים כגון ויטמינים, אנזימים, ותמציות צמחים כבר גובשה באמצעות ליפוכמה טכנולוגיה2.
ליפוזומים הם כדוריים ושלפוחיות המורכב של אחד או יותר bilayers שומנים באופן ספונטני נוצר על ידי פיזור של פוספוליפידים במדיה ימית3,4. ראשי הקוטב של הפוספוליפידים ממוקמים על המשטחים החיצוניים והפנימיים של הקרומים, במגע עם הסביבה הימית. לעומת זאת, שרשראות חומצת שומן יוצרות את ליבת ההידרופובי של הקרומים ומוגנות מהמים5. תכונות מסוימות של ליפוזומים הגורמים להם מערכות מסירה מושכת של סמים כוללים תאימות ביולוגית שלהם, biodegradability, לא חיסוני, לא רעילות, ואת היכולת להוסיף הן תרכובות הידרופיפילית ו הידרו פוביות6.
ניתן להכין ליפוזומים באמצעות שלבים שונים כגון עצבנות, sonication, שחול, ליטוטיזציה, הקפאה והפשרה. שיטות קלאסיות כוללות אידוי לשלב הפוך, הזרקת ממס, וכלי ניקוי דיאליזה. השיטה המוחלת ביותר היא לחות דק השומנים הסרט, המכונה גם השיטה של bangham, אשר משמש להשגת צורות השומנים vesicular7,8,9,10,11. לאמטיות (מספרם של הזרחן) וגודל החלקיקים הם פרמטרים קלאסיים המשמשים לאפיון ליפוזומים כמו 1) unilamellar ושלפוחיות (ULVs), נוצר על ידי בילוליפיד זרחן ייחודי משתנה בגודל כדלקמן: i) קטן unilamellar שלפוחיות (רכבי השטח, ~ 0.02-0.20 μm), ii) גדול unilamellar ושלפוחיות (LUVs, ~ 0.2-1.0 μm), ו-iii) ענק unilamellar שלפוחיות (GUVs, > 1 μm); או 2) מולטיצ שלפוחיות (mlvs, > 0.1 μm)3,12. גודל שלפוחית הוא פרמטר חשוב כאשר בוחנים שימוש תרפויטי, כגון טיפול בסרטן, שבו גדלים של < 200 ננומטר הם אידיאליים כדי לאפשר ננו שלפוחיות לחצות את מחסום האנדותל ולהגיע רקמות מוסרי4.
בזאת, את ההליך אנקפסולציה לאחר הליחות הקלאסית של טכניקת השומנים הדק הסרט7 תוארה באמצעות טארין, צמח לקטין המאופיין חלבון כדורי הידרופילי13,14,15 . שלפוחיות ננו בגודל מיוצרים על ידי כלילת שלבים sonication ו ההבלטה בטכניקה העיקרית, וכתוצאה מכך שלפוחית ליפוזומלית יציבה עם יעילות מלכודת גבוהה16.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה נבדק על ידי Correa et al.16 כדי לכסיאת טארין, מתוקקים ואנטי מוסרי לאנטין מטוהרים מקולקסיה . המתודולוגיה הניבה תוצאות מוצלחות, המאפשר ייצור nanoliposomes יציבים בגודל המתאים עבור יישומים טיפוליים. ניסוח מציג שחרור נשלט ברמות pH שונים בתנאים פיסיולוגיים. זה גם פוטנציאל התכונות הפרמקולוגית של טארין, כגון עיכוב של האדם גליובלסטומה U-87 MG וסרטן השד מד א-MB-231 תאים וגירוי של תאים במח העצם העצמות. הכנה ליפוזומלית הציגה השפעות רעילים בתאי עכברים בריאים בתאים16.
השיטה הקלאסית, שתוארה לראשונה על-ידי באנגהאם ואח ‘7, מאפשרת ייצור ליפולי מולטיצ’יני גדול ושלפוחיות, הטרוגנית בגודל ובצורה. עיבודים של שיטה זו, כפי שדווחו במחקר הנוכחי, מוחלים בהצלחה על ידי כולל שלבים נוספים כגון sonication ו שחול באמצעות קרום פוליקרבונט 0.2 יקרומטר. זה מאפשר ייצור של פיזור הומוגנית יותר לגבי גודל בטווח ננומטר16,23,24. לכן, כדי להבטיח תוצאות מוצלחות, פרוטוקול עטיפת האנקפסולציה וניסוח היפוזומיום המתוארים כאן יש לעקוב בקפדנות.
הרכב nanoliposome סוימים נבחר בקפידה על מנת להבטיח את היווצרות קרום bilayer עם סמים, MPEG 2000-DSPE, ו CHEMS כמו המרכיבים העיקריים. אלה הם טבעי בעלי חיים ממברנה bilayer המרכיבים והאחרון יכול להיוועץ נזילות כדי nanoliposome סוימים אדריכלות, להבטיח יישום רחב עבור המסירה מורכבים אקטיביים בבני אדם.
הננו-פוטוליציה היא חיונית כדי להבטיח ליפוכמה יציבות המבנה. העדר של פג מוביל להגדלת גודל, מדד רב מאוד באיכות גבוהה, ויעילות מלכודת נמוכה. תוצאות אופטימליות ניתן להשיג עם סמים כמו המרכיב העיקרי ליפוחלק. עם זאת, זהו פוספוליפיד בעלות גבוהה. העלויות הכספיות של הייצור nanoliposome יכול להיות מושגת על ידי החלפת סמים עם שומנים דומים אחרים כגון הדוג (1, 2-dioleoyl-sn-גליקו-3-פוספהולין). CHEMS היא מולקולה כולסטרול נמצא באופן טבעי ממברנות תא בעלי חיים, אשר לא צריך להיות מנשלל מן הניסוח, מאז חשוב להבטיח נזילות bilayer השומנים ו malleability16.
היבטים אחרים של פרוטוקול אנקפסולציה ניתן גם להתאים. הכלורופורם המשמש לפזר את הרכיבים ליפוזומיום יכול בקלות להיות מוחלף על ידי מתנול ללא השפעות על גודל ממוצע, הומוגניות, ויעילות מלכודת. עם זאת, דליפת חלבונים מסוימים עלולה להתרחש באחסון תחת 4 ° צ’16. השלב הדגירה לילה עם פתרון אמוניום גופרתי המכיל טארין אינו חובה; עם זאת, לנוחות זה יכול להתבצע ללא כל נזק nanolipoזומבית מאפיינים, עטיפת משנה, או יעילות הפסדים ביציבות, כפי שמתואר על ידי Correa et al.16. השלב ההבלטה מבוצע בטמפרטורת החדר, אשר יכול להקטין את קצב הזרימה בין מזרקים אם הממברנה 0.1 יקרומטר בגודל הנקבוביות משמש.
כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש 0.2 יקרומטר ממברנה בגודל הנקבוביות או חימום של המחזיק הבלטת ממד מעל טמפרטורת המעבר ליפיד צריך להיחשב. על האנליסט להיזהר שלא לפגוע בשומנים או בחלבון שניתן להשבית ולאבד פעילות ביולוגית. לחילופין, הכנה ליפוזומלית יכול להיות דיאליזה נגד hbs במקום להשתמש בקרום לגזור על פי משקל מולקולרי חלבון. הבחירה של הטבע הכימי של המאגר שבו nanoliposomes מושעה לאחר השעיית הקשר קשורה ישירות היישום הבאים. מאז פרספקטיבות של מחקר זה כוללים vivo ו בתחום מבחנה, ההשעיה ב-HEPES מלוחים באגירה היה מספיק כדי להבטיח לא השפעות ציטוטוקסיו טווח pH קרוב לתנאים פיסיולוגיים.
ליפוזומים צריך להיות מטופלים באופן דק, בדומה לתאים חיים, כדי להשיג תמונות SEM באיכות גבוהה יותר. הליכי קיבוע וייבוש חשובים כדי להבטיח את ההדמיה של שלפוחיות קטנות ללא פגע התומכות בערכים גבוהים מ -20 kV תחת תנאי ואקום. איור 2 A, B מציג הננו-שלפוחית בינונית תואמת את הליך ההבלטה. ויזואליזציה של שלפוחיות החל מ 51-396 nm אפשרי אם הכנה לדוגמה הולם בעקבות הליך זה מבוצע. השלבים כוללים קיבעון, ייבוש על ידי הגדלת ריכוזי האתנול, והתייבשות כימית כדי למנוע היווצרות של אגרגטים ושלפוחיות הנגרמת על ידי ואקום והאלקטרונים קרן. מצד שני, איור 2ג, D מראה ליפושלפוחיות מיובשות בטמפרטורת החדר ולא נתון כל הטיפולים המתוארים כאן, כלומר הם היו מוכנים כראוי. כתוצאה מהליך מתאים, שלפוחיות ענק נוצרות, גם לאחר שחול באמצעות קרום 0.2 יקרומטר בגודל הנקבוביות. שלפוחיות שנקרעו נצפו גם הן בחלוניות כתוצאה מפגיעה בוואקום ובקרן האלקטרונים.
Nanoliposome סוימים ושלפוחיות נחקרו כמערכת אנקפסולציה ומשלוח עבור מולקולות הידרופובי, כולל רזברטרול (3, 5, 4 ‘-trihydroxyבנות), מתחם אקטיביים נגד תאים סרטניים המעי הגס. הליך האנקפסולציה יכול להתגבר על מסיסות העניים של תרכובות ליפופילית בנוסף לאספקת biocompatibility, biodegradability, non-אימונוגלוגניות, ומאפיינים שאינם רעילות הטבועה ליפוכמה nanocapsules25. יש לקחת בחשבון את העיבודים בפרוטוקול, בהתאם לתוואי הניהול ולמטרה, כגון פיתוח ליפופי ניסוחים חדשים לניהול בעל פה.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים בפני המעבדה האלקטרונית, מעבדת מיקרוסקופ אלקטרוני ואפיון חומרים מרובי משתמשים; לד ר אדאלברטו ויירא, ד ר ג’ניפר לאו, ורפאל ליניסו, פרופסורים מאוניברסיטת אוניברסיאנדייד למען ריו דה ז’ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש בultracentrifuge; לד ר אלכסנדר אפדס טורס ודניאל פרון, פרופסורים באוניברסיטודייד למשל ריו דה ז’ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש של מאייד רוטרי; לפרופ ‘ רולנד בודמאייר וד ר אנדריי דאבצקי מהעיר הגרמנית בברלין, שסייעו במשאבים, סיפקה מתודולוגיות חדשות, והשגחת ACNTF במהלך 6 חודשי התמחות בבית ארסמוס + בגרמניה; לד ר רוג’יאנה צמאה ואלין פרנאנדס, פרופסור וטכנאי באוניברסיסיה הפדרלית, ריו דה ז’ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש Zetasizer מלוורן; לבלומה גות’ר ולטסה רודריגז, פרופסור וטכנאי באוניברסיטדייד הפדרלי באוניברסיטת ריו דה ז’ניירו, UFRJ, ברזיל, לשימוש SEM; לד ר רייצ’ל אן האוזר דייוויס, חוקרת בפונדסאו אוסולדו קרוז, למלל נלווה. מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון, ברזיל (שכמיות)-קוד כספים 001 (גרנט No. 1627392; 1811605); על ידי הפונדה קרלוס צ’אס פילסו דה אמאפו à Pesquisa do אסטאדו דו ריו דה ז’ניירו (להעניק לא. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 ו-E-26/202.860/2016); על ידי Conselho הלאומי דה Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) (מענק No. 406601/2018-6), ו ככלכלית דה Estudos e Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |