Denna studie beskriver klassisk hydrering med hjälp av tunn lipid film metod för nanoliposome beredning följt av nanopartiklar karakterisering. En 47 kDa-hydrofila och klotformig protein, Tarin, är framgångsrikt inkapslad som en strategi för att förbättra stabiliteten, undvika snabb clearance, och främja kontrollerad frisättning. Metoden kan anpassas till hydrofoba molekyler inkapsling.
Liposom nanocapsules har tillämpats för många ändamål inom läkemedels-, kosmetik-och livsmedelsindustrin. Attribut av liposomer inkluderar deras biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, icke-toxicitet, och förmåga att snärja både hydrofila och hydrofoba föreningar. Den klassiska hydratiseringen av tunna lipidfilmer i ett organiskt lösningsmedel appliceras häri som en teknik för att kapsla in Tarin, en växtlectin, i nanoliposomes. Nanoliposome storlek, stabilitet, Entrapment effektivitet, och morfologisk karakterisering beskrivs i detalj. De nanoliposomes bereds med 1,2-dioleoyl-SN-glycerol-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[Amino (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt; DSPE-MPEG 2000) och cholesterylhemisuccinat (CHEMS) som huvudbeståndsdelar. Lipider löses först i kloroform för att få en tunn lipidfilm som därefter återhydreras i ammoniumsulfatlösning som innehåller det protein som skall snärtas och inkuberas över natten. Sedan, ultraljudsbehandling och extrudering tekniker tillämpas för att generera nanosized små blåsor. Nanovesikelets storlek och polydispertion index bestäms av dynamisk ljusspridning, medan nanovesikler morfologi bedöms genom scanning elektronmikroskopi. Entrapment effektivitet bestäms av förhållandet mellan mängden oinkapslade protein till ursprungliga mängden initialt laddade protein. Homogena liposomer erhålls med en genomsnittlig storlek på 155 nm och polydispersitet indexvärdet 0,168. En hög Entrapment effektivitet på 83% uppnås.
Antalet studier som undersöker effektiva system för läkemedelsleverans har stigit under de senaste åren. Men, begränsningar såsom snabb clearance, dålig biodistribution, och löslighet vid Fysiologiskt pH och otillräckligt cellulära upptag behöver fortfarande överträffas. Användningen av nanosystem har vuxit fram som de senaste framstegen i cancer Therapeutics, tillämpas för att öka den intracellulära koncentrationen av läkemedel inuti cancerceller samtidigt minimera toxicitet i friska celler. Nanopartiklar som erhålls från olika material (t. ex. polymerer, dendrimerer, liposomer, virus, kolnanorör och metaller som järnoxid och guld) används för närvarande för att förbättra anticancereffekter och minska systemisk toxicitet1. Liposome nanocapsules i synnerhet har tillämpats för många ändamål inom läkemedels-, kosmetik-och livsmedelsindustrin. Under de senaste åren, olika nutraceutical produkter såsom vitaminer, enzymer, och örtextrakt har formulerats med hjälp av Liposom teknik2.
Liposomer är sfäriska blåsor som består av en eller flera koncentriska lipidbilayers spontant bildas genom spridning av fosfolipider i vattenhaltiga medier3,4. De polära huvuden av fosfolipider är placerade på de yttre och inre ytorna av membranen, i kontakt med vattenmiljön. Fettsyra kedjor bildar däremot den hydrofoba kärnan i membranen och skyddas från vatten5. Vissa attribut av liposomer som gör dem attraktiva läkemedel leveranssystem inkluderar deras biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, icke-toxicitet, och förmåga att snärja både hydrofila och hydrofoba föreningar6.
Liposomer kan förberedas med hjälp av olika processer steg såsom agitation, ultraljudsbehandling, extrudering, frystorkat, frysning, och upptinning. Klassiska metoder inkluderar omvänd fas avdunstning, lösningsmedels injektion, och tvättmedel dialys. Den mest tillämpade metoden är tunn lipid film hydrering, även känd som bangham metod, som används för att få vesikulär-lipid former7,8,9,10,11. Lamellaritet (antalet fosfolipidbilayers) och partikelstorlek är klassiska parametrar som används för att karakterisera liposomer som antingen 1) små blåsor (Ulvs), som bildas av en unik fosfolipid lipidens och varierande i storlek enligt följande: i) små små blåsor (stadsjeepar, ~ 0,02-0,20 μm), II) stora små blåsor (luvs, ~ 0,2-1,0 μm), och III) Giant små blåsor (guvs, > 1 μm); eller 2) multilamellärt blåsor (MLVs, > 0,1 μm)3,12. Vesikler storlek är en viktig parameter när man överväger för terapeutisk användning, såsom i cancerbehandling, i vilka storlekar av < 200 Nm är idealiska för att tillåta nanovesikler att korsa endotelbarriären och nå tumoral vävnader4.
Häri, inkapsling förfarande efter den klassiska hydrering av en tunn lipid film teknik7 beskrevs med hjälp av Tarin, en växt lektin kännetecknas som ett hydrofila globulära protein13,14,15 . Nanosized blåsor produceras genom att inkludera ultraljudsbehandling och extrudering steg i huvud tekniken, vilket resulterar i stabila liposomala nanovesicles med hög Entrapment effektivitet16.
Det protokoll som beskrivs häri testades av Correa et al.16 för att kapsla Tarin, en immunmodulerande och antitumöreffekt lektin renas från Colocasia esculenta22. Metoden gav framgångsrika resultat, vilket möjliggjorde produktion av stabila nanoliposomes av lämplig storlek för terapeutiska tillämpningar. Formuleringen presenterar kontrollerad frisättning vid olika pH-nivåer under fysiologiska förhållanden. Det potentierar också Tarin farmakologiska egenskaper, såsom hämning av humant glioblastoma U-87 MG och bröstcancer MDA-MB-231 cellinjer och stimulering av möss benmärgsceller. Den liposomala preparatet uppvisade inga toxiska effekter i friska möss celler16.
Den klassiska metoden, som först beskrevs av Bangham et al.7, möjliggör produktion av stora multilamellära Liposom blåsor, heterogena i storlek och form. Anpassningar av denna metod, som rapporterats i den aktuella studien, tillämpas framgångsrikt genom att inkludera ytterligare steg såsom ultraljudsbehandling och extrudering genom en 0,2 μm polykarbonatmembran. Detta möjliggör produktion av en mer homogen dispersion när det gäller storlek i nanometerområdet16,23,24. Därför, för att säkerställa framgångsrika resultat, inkapsling protokoll och liposomalt formulering som beskrivs här bör följas strikt.
Den nanoliposome sammansättningen var noga utvalda för att säkerställa bildandet av ett lipidens membran med knark, MPEG 2000-dspe, och Chems som de viktigaste beståndsdelarna. Dessa är naturliga djur membran lipidens beståndsdelar och den senare kan ge smidighet till nanoliposome arkitektur, säkerställa en bred tillämpning för bioaktiva sammansatta leverans i människor.
Nanoliposome pegylering är viktigt för att garantera Liposom struktur stabilitet. Avsaknaden av PEG leder till storleks utvidgning, en hög polydispersitet index, och låg Entrapment effektivitet. Optimala resultat kan erhållas med DOPE som den viktigaste Liposom komponenten. Detta är dock en hög kostnad fosfolipid. De finansiella kostnaderna för nanoliposome produktion kan uppnås genom att ersätta knark med andra liknande lipider såsom DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin). CHEMS är en kolesterol molekyl som finns naturligt i animaliska cellmembran, som inte bör uteslutas från formuleringen, eftersom det är viktigt att säkerställa lipidbilayer fluiditet och formbarhet16.
Andra aspekter av inkapsling protokollet kan också anpassas. Den kloroform som används för att lösa upp liposomala komponenter kan lätt ersättas med metanol utan effekter på storlek genomsnitt, homogenitet, och Entrapment effektivitet. Vissa Proteinläckage kan dock förekomma vid förvaring under 4 ° c16. Inkubations steget över natten med ammoniumsulfatlösning som innehåller Tarin är inte obligatoriskt. emellertid, för enkelhetens skull kan det utföras utan skador på nanoliposomala biofysiska egenskaper, inkapsling, eller stabilitet effektivitetsförluster, vilket framgår av Correa et al.16. Extrudering steg utförs vid rumstemperatur, vilket kan minska flödet mellan sprutorna om en 0,1 μm porstorlek membran används.
För att övervinna denna fråga bör användning av en 0,2 μm porstorlek membran eller uppvärmning av extruder innehavaren över lipidövergångstemperaturen övervägas. Analytikern måste vara noga med att inte skada lipider eller protein som kan inaktiveras och förlorar biologisk aktivitet. Alternativt kan liposomalt preparat dialyseras mot HBS i stället för ultracentrifugation, med hjälp av ett cut-off membran enligt proteinmolekyl vikt. Valet av kemisk typ av den buffert i vilken nanoliposomes avbryts efter ultracentrifugering är direkt relaterad till dess efterföljande tillämpning. Eftersom perspektiv av denna studie inkluderar in vivo och in vitro-analyser, suspension i HEPES buffrad saltlösning var tillräcklig för att säkerställa inga cytotoxiska effekter och ett pH-intervall nära fysiologiska förhållanden.
Liposomer bör behandlas fint, liknande levande celler, för att få högre kvalitet SEM bilder. Fixering och torkning är viktiga för att säkerställa visualisering av mindre intakta blåsor som stöder värden högre än 20 kV under vakuum förhållanden. Figur 2 A, B visar nanostora blåsor kompatibla med extrudering förfarande. Visualisering av blåsor som sträcker sig från 51-396 Nm är möjlig om adekvat provberedning efter denna procedur utförs. Stegen inkluderar fixering, torkning genom att öka etanol koncentrationer, och kemisk uttorkning för att undvika bildandet av aggregat och spruckna blåsor orsakade av vakuum och elektronstråle. Å andra sidan, figur 2C, D visar Liposom blåsor torkade under rumstemperatur och inte utsätts för någon behandling som beskrivs här, vilket innebär att de var beredda otillräckligt. Som ett resultat av det otillräckliga förfarandet bildas jätte blåsor, även efter extrudering genom ett membran med porstorlek på 0,2 μm. Spruckna blåsor observeras också i båda panelerna som ett resultat av vakuum-och elektronstråle skador.
Nanoliposome blåsor har undersökts som en inkapsling och leveranssystem för hydrofoba molekyler, inklusive resveratrol (3, 5, 4 ‘-trihydroxystilbene), en bioaktiva förening mot kolorektal cancerceller. Inkapslingen förfarandet kan övervinna den dåliga lösligheten av lipofila föreningar förutom att ge biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, icke-immunogenicitet, och icke-toxiska egenskaper inneboende till Liposom nanocapsules25. Protokoll anpassningar måste beaktas beroende på administreringsväg och syfte, såsom utveckling av nya Liposom formuleringar för oral administrering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för COPPE/UFRJ, elektronisk Microscopy laboratorium, och Fleranvändarmaterial karakterisering laboratorieanläggningar; till Dr. Adalberto vieyra, Dr. Jennifer Lowe, och Rafael Lindoso, professorer vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av ultracentrifuge; till Dr Alexandre Guedes Torres och Daniel Perrone, professorer vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av Rotary indunstare; till professor Roland Bodmeier och Dr. Andriy Dashevskiy från Freie Universität i Berlin, som hjälpte till med resurser, tillhandahöll nya metoder och övervakade ACNTF under ett 6 månaders Erasmus +-stipendium i Tyskland; till Dr Rossana Thiré och Aline Fernandes, professor och tekniker vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av ZetaSizer Malvern; till BLUMA Guenther och Taissa Rodrigues, professor och tekniker vid Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasilien, för användning av SEM; till Dr Rachel Ann Hauser Davis, forskare vid Fundação Oswaldo Cruz, för berättande. Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES)-finans kod 001 (Grant nr 1627392; 1811605); av Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Grant No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 och E-26/202.860/2016); av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Grant nr 406601/2018-6), och Financiadora de estudos e Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |