Cette étude décrit l’hydratation classique utilisant la méthode mince de film de lipide pour la préparation de nanoliposome suivie de la caractérisation de nanoparticules. Une protéine 47 kDa-hydrophile et globulaire, la tarine, est avec succès encapsulée comme stratégie pour améliorer la stabilité, éviter le dégagement rapide, et favoriser la libération contrôlée. La méthode peut être adaptée à l’encapsulation des molécules hydrophobes.
Les nanocapsules liposome ont été appliquées à de nombreuses fins dans les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Les attributs des liposomes incluent leur biocompatibilité, biodégradabilité, non-immunogénicité, non-toxicité, et capacité de piéger les composés hydrophiles et hydrophobes. L’hydratation classique des couches lipidiques minces dans un solvant organique est appliquée ici comme technique pour encapsuler la tarine, une lectine végétale, dans les nanoliposomes. La taille nanoliposome, la stabilité, l’efficacité de piégeage, et la caractérisation morphologique sont décrites en détail. Les nanoliposomes sont préparés à l’aide de 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyéthylène glycol)-2000] (sel d’ammonium; DSPE-MPEG 2000), et le cholesterylhemisuccinate (CHEMS) en tant que constituants principaux. Les lipides sont d’abord dissous dans le chloroforme pour obtenir un film lipidique mince qui est ensuite réhydraté dans la solution de sulfate d’ammonium contenant la protéine à piéger et incubé pendant la nuit. Ensuite, des techniques de sonication et d’extrusion sont appliquées pour générer des vésicules unilamellar nanométriques. La taille et l’indice de polydispersité des nanovésicules sont déterminés par la diffusion dynamique de la lumière, tandis que la morphologie des nanovésicules est évaluée par microscopie électronique à balayage. L’efficacité du piégeage est déterminée par le rapport entre la quantité de protéines non encapsulées et la quantité originale de protéines initialement chargées. Les liposomes homogènes sont obtenus avec une taille moyenne de 155 nm et la valeur de l’indice de polydispersity de 0,168. Une efficacité de piégeage élevée de 83% est atteinte.
Le nombre d’études portant sur des systèmes efficaces d’administration de médicaments a augmenté au cours des dernières années. Cependant, des limitations telles que le dégagement rapide, la biodistribution pauvre, et la solubilité au pH physiologique et l’utilisation cellulaire insuffisante doivent encore être dépassées. L’utilisation des nanosystèmes a émergé comme progrès récents dans la thérapeutique du cancer, appliquée pour augmenter la concentration intracellulaire de médicaments à l’intérieur des cellules cancéreuses tout en minimisant la toxicité dans les cellules saines. En outre, des nanoparticules obtenues à partir d’une gamme différente de matériaux (c.-à-d. polymères, dendrimères, liposomes, virus, nanotubes de carbone et métaux tels que l’oxyde de fer et l’or) sont actuellement appliquées pour améliorer les effets anticancéreux et réduire les toxicité1. Les nanocapsules liposome en particulier ont été appliquées à de nombreuses fins dans les industries pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Ces dernières années, divers produits nutraceutiques tels que les vitamines, les enzymes et les extraits de plantes à base de plantes ont été formulés à l’aide de la technologie liposome2.
Les liposomes sont des vésicules sphériques composées d’un ou plusieurs bicouches lipidiques concentriques spontanément formées par la dispersion des phospholipides dans les médias aqueux3,4. Les têtes polaires des phospholipides sont situées sur les surfaces extérieures et intérieures des membranes, en contact avec l’environnement aqueux. En revanche, les chaînes d’acides gras forment le noyau hydrophobe des membranes et sont protégées de l’eau5. Certains attributs des liposomes qui en font des systèmes attrayants d’administration de médicaments incluent leur biocompatibilité, biodégradabilité, non-immunogénicité, non-toxicité, et capacité de piéger les composés hydrophiles et hydrophobes6.
Les liposomes peuvent être préparés à l’aide de diverses étapes de processus telles que l’agitation, la sonication, l’extrusion, la lyophilisation, la congélation et la décongélation. Les méthodes classiques incluent l’évaporation de phase inverse, l’injection de solvant, et la dialyse de détergent. La méthode la plus appliquée est l’hydratation mince de film lipidique, également connu sous le nom de méthode de Bangham, qui est employé pour obtenir les formes vésiculaires-lipidiques7,8,9,10,11. La lamillarité (le nombre de bicouches phospholipides) et la taille des particules sont des paramètres classiques utilisés pour caractériser les liposomes comme 1) vésicules unilamellar (ULV), formé par un bilayer phospholipid unique et de taille variable comme suit: i) petit unilamellar vésicules (VUS, 0,02-0,20 m), ii) de grandes vésicules unilamellar (VJ, 0,2 à 1,0 m) et iii) de vésicules unilamellar géantes (VGU, 1 m) ; ou 2) vésicules multilamellar (MLV, ‘0.1 ‘m)3,12. La taille de la vésicule est un paramètre important lors de l’examen d’une utilisation thérapeutique, comme dans le traitement du cancer, dans lequel les tailles de 200 nm sont idéales pour permettre aux nanovésicules de traverser la barrière endothéliale et d’atteindre les tissus tumoraux4.
Ici, la procédure d’encapsulation suivant l’hydratation classique d’une technique mince de film de lipide7 a été décrite utilisant la tarine, une lectine végétale caractérisée comme protéine globulaire hydrophile13,14,15 . Les vésicules nanométriques sont produites en incluant des étapes de sonication et d’extrusion dans la technique principale, résultant en nanovésicules liposomiques stables avec une efficacité de piégeage élevée16.
Le protocole décrit ci-temps a été testé par Correa et coll.16 pour encapsuler la tarine, une lectine immunomodulatrice et antitumorale purifiée de Colocasia esculenta22. La méthodologie a donné des résultats réussis, permettant la production de nanoliposomes stables de taille appropriée pour des applications thérapeutiques. La formulation présente la libération contrôlée à différents niveaux de pH dans des conditions physiologiques. Il potentialise également les propriétés pharmacologiques de tarin, telles que l’inhibition du glioblastome humain U-87 MG et du cancer du sein MDA-MB-231 lignes cellulaires et la stimulation des cellules de moelle osseuse de souris. La préparation liposomique n’a montré aucun effet toxique dans les cellules saines de souris16.
La méthode classique, décrite pour la première fois par Bangham et al.7, permet la production de grandes vésicules multilamellar liposome, hétérogènes dans la taille et la forme. Les adaptations de cette méthode, telles que rapportées dans la présente étude, sont appliquées avec succès en incluant des étapes supplémentaires telles que la sonication et l’extrusion à travers une membrane de polycarbonate de 0,2 m. Cela permet la production d’une dispersion plus homogène en ce qui concerne la taille dans la gamme nanométrique16,23,24. Par conséquent, pour assurer des résultats réussis, le protocole d’encapsulation et la formulation liposomique décrite ici devraient être strictement suivis.
La composition nanoliposome a été soigneusement sélectionnée afin d’assurer la formation d’une membrane bicouche avec DOPE, MPEG 2000-DSPE, et CHEMS comme constituants principaux. Il s’agit de constituants naturels de la membrane animale et ces derniers peuvent conférer de fluidité à l’architecture nanoliposome, assurant une large application pour la livraison de composés bioactifs chez les êtres humains.
La pegylation nanoliposome est essentielle pour garantir la stabilité de la structure liposome. L’absence de PEG conduit à l’élargissement de taille, à un indice de polydispersity élevé, et à une faible efficacité de piégeage. Des résultats optimaux peuvent être obtenus avec DOPE comme principal composant liposome. Cependant, il s’agit d’un phospholipide coûteux. Les coûts financiers de la production de nanoliposomes peuvent être atteints en remplaçant DOPE par d’autres lipides similaires tels que DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine). CHEMS est une molécule de cholestérol naturellement trouvée dans les membranes cellulaires animales, qui ne doit pas être exclue de la formulation, car il est important d’assurer la fluidité et la malléabilité des lipides bicouches16.
D’autres aspects du protocole d’encapsulation peuvent également être adaptés. Le chloroforme utilisé pour dissoudre les composants liposomiques peut facilement être remplacé par du méthanol sans effets sur la moyenne de taille, l’homogénéité et l’efficacité de piégeage. Cependant, certaines fuites de protéines peuvent se produire au stockage en dessous de 4 oC16. L’étape d’incubation de nuit avec la solution de sulfate d’ammonium contenant de la tarine n’est pas obligatoire; cependant, pour plus de commodité, il peut être effectué sans endommager les caractéristiques biophysiques nanoliposomiques, l’encapsulation, ou les pertes d’efficacité de stabilité, comme démontré par Correa et autres16. L’étape d’extrusion est effectuée à température ambiante, ce qui peut diminuer le débit entre les seringues si une membrane de taille de 0,1 m de pore est utilisée.
Pour surmonter ce problème, il faut envisager l’utilisation d’une membrane de taille pore de 0,2 m ou d’un chauffage du support extrudeur au-dessus de la température de transition lipidique. L’analyste doit faire attention à ne pas endommager les lipides ou les protéines qui peuvent être inactivés et perdre l’activité biologique. Alternativement, la préparation liposomique peut être dialysée contre HBS au lieu de l’ultracentrifugation, en utilisant une membrane de coupure en fonction du poids moléculaire des protéines. Le choix de la nature chimique du tampon dans lequel les nanoliposomes sont suspendus après l’ultracentrifugation est directement lié à son application ultérieure. Puisque les perspectives de cette étude incluent in vivo et in vitro des essais, la suspension dans la saline tamponnée de HEPES était suffisante pour assurer aucun effet cytotoxique et une gamme de pH proche des conditions physiologiques.
Les liposomes doivent être finement traités, semblables aux cellules vivantes, pour obtenir des images SEM de meilleure qualité. Les procédures de fixation et de séchage sont importantes pour assurer la visualisation de vésicules intactes plus petites qui supportent des valeurs supérieures à 20 kV dans des conditions de vide. Figure 2 A,B affiche des vésicules nanométriques compatibles avec la procédure d’extrusion. La visualisation des vésicules allant de 51-396 nm est possible si la préparation adéquate d’échantillon suivant cette procédure est exécutée. Les étapes comprennent la fixation, le séchage par l’augmentation des concentrations d’éthanol, et la déshydratation chimique pour éviter la formation d’agrégats et de vésicules rompues causées par le vide et le faisceau d’électrons. D’autre part, la figure 2C,D montre des vésicules liposome séchées sous la température ambiante et non soumises à aucun traitement décrit ici, ce qui signifie qu’elles ont été mal préparées. À la suite de la procédure inadéquate, des vésicules géantes sont formées, même après l’extrusion à travers une membrane de taille de 0,2 m pore. Des vésicules rompues sont également observées dans les deux panneaux en raison de dommages causés par le vide et le faisceau d’électrons.
Les vésicules nanoliposome ont été explorées comme système d’encapsulation et de livraison pour les molécules hydrophobes, y compris le resvératrol (3,5,4′-trihydroxystilbene), un composé bioactif contre les cellules cancéreuses colorectales. La procédure d’encapsulation peut surmonter la faible solubilité des composés lipophiles en plus de fournir la biocompatibilité, la biodégradabilité, la non-immunogénicité, et les caractéristiques de non-toxicité inhérentes aux nanocapsules liposome25. Les adaptations du protocole doivent être prises en considération en fonction de l’itinéraire administratif et de l’objectif, tels que le développement de nouvelles formulations liposome pour l’administration orale.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs sont reconnaissants envers les installations du COPPE/UFRJ, du Laboratoire de microscopie électronique et du Laboratoire de caractérisation des matériaux multiutilisateurs; au Dr Adalberto Vieyra, au Dr Jennifer Lowe et à Rafael Lindoso, professeurs à l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l’utilisation de l’ultracentrifuge; au Dr Alexandre Guedes Torres et Daniel Perrone, professeurs à l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l’utilisation de l’évaporateur rotatif; au professeur Roland Bodmeier et au Dr Andriy Dashevskiy de l’Université Freie de Berlin, qui ont aidé avec des ressources, fourni de nouvelles méthodologies et supervisé l’ACNTF au cours d’une bourse ErasmusMD de 6 mois en Allemagne; à Dr Rossana Thiré et Aline Fernandes, professeure et technicienne à l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l’utilisation du Zetasizer Malvern; à Bluma Guenther et Taissa Rodrigues, professeur et technicien à l’Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brésil, pour l’utilisation de la SEM; à la Dre Rachel Ann Hauser Davis, chercheuse à Fundaçao Oswaldo Cruz, pour la narration. Cette étude a été financée en partie par le Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nvel Superior, Brasil (CAPES) – Code des finances 001 (subvention no 1627392; 1811605); par Fundaçao Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (subvention No. E-26/202.815/2018; E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 et E-26/202.860/2016); par Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient-fico e Tecnolàgico (CNPq) (subvention no 406601/2018-6), et Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |