خط أنابيب كامل لعزل وتسلسل MicroRNAs، وتحليلها باستخدام أدوات المصادر المفتوحة
Summary
هنا، نقوم بوصف استراتيجية خطوة بخطوة لعزل RNAs الصغيرة، وإثراء microRNAs، وإعداد عينات لتسلسل الإنتاجية العالية. ثم نقوم بوصف كيفية معالجة تسلسل القراءة ومحاذاتها إلى microRNAs، وذلك باستخدام أدوات مفتوحة المصدر.
Abstract
ويعتقد أن نصف جميع النصوص البشرية تنظمها microRNAs. ولذلك، يمكن أن يكشف التحديد الكمي للتعبير microRNA الآليات الكامنة في حالات المرض وتوفير الأهداف العلاجية والمؤشرات الحيوية. هنا، نقوم بتفصيل كيفية قياس الميكروRNAs بدقة. باختصار، يصف هذا الأسلوب عزل microRNAs، ربطها إلى محولات مناسبة لتسلسل الإنتاجية العالية، تضخيم المنتجات النهائية، وإعداد مكتبة عينة. ثم، نشرح كيفية محاذاة قراءات التسلسل التي تم الحصول عليها إلى دبابيس الشعر microRNA، وتحديد كمية، تطبيع، وحساب التعبير التفاضلي. متعدد الاستخدامات وقوية، وهذا الجمع بين سير العمل التجريبي وتحليل المعلوماتية الحيوية تمكن المستخدمين من البدء مع استخراج الأنسجة والانتهاء مع القياس الكمي microRNA.
Introduction
اكتشفت لأول مرة في عام 19931، ويقدر الآن أن ما يقرب من 2000 microRNAs موجودة في الجينوم البشري2. MicroRNAs هي RNAs صغيرة غير الترميز التي عادة ما تكون 21-24 النيوكليوتيدات طويلة. هم منظمون ما بعد النسخ للتعبير الجيني، وغالبا ما تكون ملزمة لمواقع تكميلية في المنطقة 3-Untranslated (3-UTR) من الجينات المستهدفة لقمع التعبير البروتين يتحلل mRNA. ويمكن أن يعطي التحديد الكمي للميكروRNAs نظرة ثاقبة قيّمة في التعبير الجيني وقد وضعت عدة بروتوكولات لهذا الغرض3.
لقد قمنا بتطوير بروتوكول محدد، قابل للاستنساخ، وطويل الأمد لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير، ولتحليل القراءات الطبيعية باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر. الأهم من ذلك، بروتوكولنا يتيح التعرف في وقت واحد على كل من microRNAs الذاتية وبنيت تسليمها من الخارج التي تنتج الأنواع الشبيهة microRNA، في حين تقليل يقرأ تلك الخريطة لأنواع الرنا الصغيرة الأخرى، بما في ذلك RNAs ريبوسومال ( rRNAs)، نقل RNAs الصغيرة المشتقة من الحمض النووي الريبي (tsRNAs)، RNAs الصغيرة المشتقة من التكرار، ومنتجات تحلل mRNA. لحسن الحظ، microRNAs هي 5-فوسفوريلات و2-3 هيدروكسيلاد 4، وهي ميزة التي يمكن الاستفادة منها لفصلها عن هذه RNAs الصغيرة الأخرى ومنتجات تدهور mRNA. توجد عدة خيارات تجارية لاستنساخ وتسلسل microRNA التي غالباً ما تكون أسرع وأسهل لمضاعفات; ومع ذلك، فإن طبيعة الملكية من الكواشف عدة وتعديلاتها المتكررة يجعل مقارنة عينة يعمل تحديا. استراتيجيتنا يحسن جمع فقط الحجم الصحيح من microRNAs من خلال الأكريلاميد وخطوات تنقية هلام أغاروز. في هذا البروتوكول، نقوم أيضًا بوصف إجراء لمحاذاة تسلسل القراءة إلى microRNAs باستخدام أدوات مفتوحة المصدر. هذه المجموعة من التعليمات ستكون مفيدة بشكل خاص لمستخدمي المعلوماتية المبتدئين، بغض النظر عما إذا كان يتم استخدام طريقة إعداد المكتبة أو طريقة تجارية.
وقد استخدم هذا البروتوكول في العديد من الدراسات المنشورة. على سبيل المثال، تم استخدامه لتحديد الآلية التي أنزيم ديسير يشق RNAs دبوس الشعر الصغيرة على مسافة اثنين من النيوكليوتيدات من الحلقة الداخلية من هيكل حلقة الجذعية – ما يسمى “حلقة العد قاعدة”5. كما اتبعنا هذه الطرق لتحديد الوفرة النسبية لRNAs دبوس الشعر الصغيرة تسليم (shRNA) أعرب عنها من ناقلات الفيروسية المرتبطة بالدينو المؤتلف (rAAVs)، لتحديد عتبة التعبير shRNA التي يمكن التسامح معها قبل الكبد السمية المرتبطة بالتعبير الزائد shRNA6. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا أيضا microRNAs في الكبد التي تستجيب لعدم microRNA-122 – microRNA الكبدي أعرب للغاية – في حين تتميز أيضا نمط تدهور هذا microRNA7. لأننا استخدمنا بروتوكولنا باستمرار في العديد من التجارب، تمكنا من مراقبة الاستعدادات عينة طوليا، ونرى أنه لا توجد آثار دفعة واضحة.
في تقاسم هذا البروتوكول، هدفنا هو تمكين المستخدمين من توليد جودة عالية، والقياس الكمي القابلة للاستنساخ من microRNAs في أي الأنسجة أو خط الخلية تقريبا، وذلك باستخدام معدات بأسعار معقولة والكواشف، وأدوات المعلوماتية الحيوية مجانا.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من تحديد microRNAs منذ أكثر من 20 عاما13، فإن عملية تسلسل microRNA لا تزال شاقة وتتطلب معدات متخصصة ، مما يعوق المختبرات من اعتماد البروتوكولات الداخلية بشكل روتيني14. تقنيات أخرى يمكن أن تقيم في وقت واحد microRNAs، مثل microRNA microarrays ولوحات التعبير متعددة المضاعفات؛ ومع ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء مختبرات أندرو فاير ومارك كاي على التوجيه والاقتراحات.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
Referências
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
