En fullstendig rørledning for isolere og sekvensering MicroRNAs, og analyserer seg benytter åpen kilde verktøy
Summary
Her beskriver vi en trinnvis strategi for å isolere små RNAs, berikende for microRNAs og klargjøre prøver for sekvenser med høy gjennomstrømming. Vi beskriver hvordan du behandler sekvensen leser og justere dem til microRNAs, ved hjelp av åpen kildekode-verktøy.
Abstract
Halvparten av alle menneskelige transkripsjoner antas å være regulert av microRNAs. Kvantifisere microRNA-uttrykk kan derfor avdekke underliggende mekanismer i sykdomstilstander og gi terapeutiske mål og biomarkører. Her detalj vi hvordan du nøyaktig kvantifisere microRNAs. Kort, denne metoden beskriver isolere microRNAs, ligating seg å adapter egnet til høy-produksjon sekvensering, forsterke det final produktene, og forbereder en eksemplar bibliotek. Deretter forklarer vi hvordan du kan justere den oppnådde sekvensering leser til microRNA pinner, og kvantifisere, normalisere, og beregne deres differensial uttrykk. Allsidig og robust, denne kombinert eksperimentell arbeidsflyt og Bioinformatic analyse gjør det mulig for brukere å begynne med vev utvinning og finish med microRNA kvantifisering.
Introduction
Først oppdaget i 19931, er det nå anslått at nesten 2000 microRNAs er til stede i den menneskelige Genova2. MicroRNAs er små ikke-koding RNAs som vanligvis er 21-24 nukleotider lang. De er post-transcriptional regulatorer av genuttrykk, ofte bindende for komplementære steder i 3-uoversatt regionen (3-UTR) av mål gener å undertrykke protein uttrykk og forringe mRNA. Kvantifisere microRNAs kan gi verdifull innsikt i genuttrykk og flere protokoller er utviklet for dette formålet3.
Vi har utviklet en definert, reproduserbar og langvarig protokoll for små RNA-sekvenser, og for å analysere normalisert leser ved hjelp av åpen kildekode-Bioinformatikk verktøy. Viktigere, vår protokoll muliggjør samtidig identifisering av både endogene microRNAs og exogenously levert konstruksjoner som produserer microRNA-lignende arter, mens minimere leser som kart til andre små RNA arter, inkludert ribosomal RNAs ( rRNAs), overføre RNA-avledet små RNAs (tsRNAs), REPEAT-avledet liten RNAs, og mRNA nedbrytningsprodukter. Heldigvis, microRNAs er 5-fosforylert og 2-3 hydroksylerte4, en funksjon som kan utnyttes til å skille dem fra disse andre små RNAs og mRNA fornedrelse produkter. Flere kommersielle alternativer finnes for microRNA kloning og sekvensering som ofte er raskere og enklere å multiplex; den proprietære typen av Kit-reagenser og de hyppige endringene gjør imidlertid det utfordrende å sammenligne prøvekjøringer. Strategien vår optimaliserer innsamling av kun riktig størrelse på microRNAs gjennom akrylamid og agarose. I denne protokollen beskriver vi også en prosedyre for å samkjøre sekvens leser til microRNAs ved hjelp av åpen kildekode-verktøy. Dette settet med instruksjoner vil være spesielt nyttig for uerfarne informatikk brukere, uavhengig av om vårt bibliotek forberedelse metode eller en kommersiell metode brukes.
Denne protokollen har blitt brukt i flere publiserte studier. For eksempel ble det brukt til å identifisere mekanismen som Dicer enzymet kløyver små hæler RNAs i en avstand på to nukleotider fra den interne sløyfen av stammen-loop struktur-den såkalte “loop-telling regelen”5. Vi har også fulgt disse metodene for å identifisere den relative overflod av leverte små hæler RNAs (shRNA) uttrykt fra rekombinant adeno-assosiert viral vektorer (rAAVs), for å identifisere terskelen til shRNA uttrykk som kan tolereres før leveren toksisitet forbundet med overflødig shRNA-uttrykk6. Ved hjelp av denne protokollen, vi også identifisert microRNAs i leveren som reagerer på fraværet av microRNA-122-en svært uttrykt hepatic microRNA-samtidig også karakteriserer nedbrytning mønster av denne microRNA7. Fordi vi har brukt vår protokoll konsekvent i mange eksperimenter, har vi vært i stand til å observere prøve preparater lengderetningen, og se at det ikke er noen merkbar batch effekter.
I deler denne protokollen, er vårt mål å gjøre det mulig for brukere å generere høy kvalitet, reproduserbar kvantifisering av microRNAs i praktisk talt alle vev eller cellelinje, ved hjelp av rimelig utstyr og reagenser, og gratis Bioinformatikk verktøy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for identifisering av microRNAs over 20 år siden13, prosessen med microRNA sekvensering fortsatt arbeidskrevende og krever spesialisert utstyr, hindrer laboratorier fra rutinemessig vedta interne protokoller14. Andre teknikker kan samtidig evaluere microRNAs, som microRNA Microarrays og multiplekset uttrykks paneler; Imidlertid er disse tilnærmingene begrenset i at de bare kvantifisere microRNAs stede i sin sonde satt. På grunn av dette, savner de viktige funks…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke medlemmer av laboratorier av Andrew fire og Markus Kay for veiledning og forslag.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
Referências
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Kim, V. N., Han, J., Siomi, M. C. Biogenesis of small RNAs in animals. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (2), 126-139 (2009).
- Gu, S., et al. The loop position of shRNAs and pre-miRNAs is critical for the accuracy of dicer processing in vivo. Cell. 151 (4), 900-911 (2012).
- Valdmanis, P. N., et al. RNA interference-induced hepatotoxicity results from loss of the first synthesized isoform of microRNA-122 in mice. Nature Medicine. 22 (5), 557-562 (2016).
- Valdmanis, P. N., et al. miR-122 removal in the liver activates imprinted microRNAs and enables more effective microRNA-mediated gene repression. Nature Communications. 9 (1), 5321 (2018).
- Griffiths-Jones, S. The microRNA Registry. Nucleic Acids Research. 32, D109-D111 (2004).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34 (Database issue), D140-D144 (2006).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36 (Database issue), D154-D158 (2008).
- Patro, R., Mount, S. M., Kingsford, C. Sailfish enables alignment-free isoform quantification from RNA-seq reads using lightweight algorithms. Nature Biotechnology. 32 (5), 462-464 (2014).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Etheridge, A., Wang, K., Baxter, D., Galas, D. Preparation of Small RNA NGS Libraries from Biofluids. Methods in Molecular Biology. 1740, 163-175 (2018).
- Yamane, D., et al. Differential hepatitis C virus RNA target site selection and host factor activities of naturally occurring miR-122 3 variants. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4743-4755 (2017).
- Giraldez, M. D., et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nature Biotechnology. 36 (8), 746-757 (2018).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19 (1), 118 (2018).
- Yeri, A., et al. Evaluation of commercially available small RNASeq library preparation kits using low input RNA. BMC Genomics. 19 (1), 331 (2018).
- Coenen-Stass, A. M. L., et al. Evaluation of methodologies for microRNA biomarker detection by next generation sequencing. RNA Biology. 15 (8), 1133-1145 (2018).
- Baran-Gale, J., et al. Addressing Bias in Small RNA Library Preparation for Sequencing: A New Protocol Recovers MicroRNAs that Evade Capture by Current Methods. Frontiers in Genetics. 6, 352 (2015).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), e141 (2011).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6 (10), e26969 (2011).
- Valdmanis, P. N., et al. Upregulation of the microRNA cluster at the Dlk1-Dio3 locus in lung adenocarcinoma. Oncogene. 34 (1), 94-103 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clinical Chemistry. 61 (11), 1333-1342 (2015).
- Viollet, S., Fuchs, R. T., Munafo, D. B., Zhuang, F., Robb, G. B. T4 RNA ligase 2 truncated active site mutants: improved tools for RNA analysis. BMC Biotechnology. 11, 72 (2011).
- Chiang, H. R., et al. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes & Development. 24 (10), 992-1009 (2010).
- Fromm, B., et al. A Uniform System for the Annotation of Vertebrate microRNA Genes and the Evolution of the Human microRNAome. Annual Review of Genetics. 49, 213-242 (2015).
