Isolating और अनुक्रमMicroRNAs के लिए एक पूरी पाइपलाइन, और उन्हें मुक्त स्रोत उपकरण का उपयोग का विश्लेषण
Summary
यहाँ, हम छोटे RNAs अलग करने के लिए एक कदम दर कदम रणनीति का वर्णन, microRNAs के लिए समृद्ध, और उच्च throughput अनुक्रमण के लिए नमूने की तैयारी. हम तो अनुक्रम को संसाधित करने के लिए कैसे का वर्णन पढ़ता है और उन्हें microRNAs करने के लिए संरेखित करें, खुला स्रोत उपकरण का उपयोग कर.
Abstract
सभी मानव प्रतिलिपि के आधे microRNAs द्वारा विनियमित माना जाता है. इसलिए, microRNA अभिव्यक्ति परिमाणक रोग राज्यों में अंतर्निहित तंत्र प्रकट कर सकते हैं और चिकित्सीय लक्ष्य और biomarkers प्रदान करते हैं. यहाँ, हम विस्तार से कैसे सही microRNAs मात्रा निर्धारित करने के लिए. संक्षेप में, इस विधि microRNAs अलग करने का वर्णन करता है, उन्हें उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए उपयुक्त adapters के लिए ligating, अंतिम उत्पादों बढ़ाना, और एक नमूना पुस्तकालय की तैयारी. फिर, हम समझा कैसे प्राप्त अनुक्रमण संरेखित करने के लिए microRNA hairpins को पढ़ता है, और मात्रा, सामान्य, और उनके अंतर अभिव्यक्ति की गणना. बहुमुखी और मजबूत, इस संयुक्त प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह और bioinformatic विश्लेषण उपयोगकर्ताओं ऊतक निष्कर्षण और microRNA परिमाणीकरण के साथ खत्म करने के साथ शुरू करने के लिए सक्षम बनाता है.
Introduction
पहली बार 19931में खोज की गई , अब यह अनुमान लगाया गया है कि मानव जीनोम2में लगभग 2000 माइक्रोआरएन मौजूद हैं . MicroRNAs छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो आम तौर पर 21-24 न्यूक्लिओटाइड लंबे होते हैं। वे जीन अभिव्यक्ति के बाद-transcriptional नियामकों, अक्सर 3-untranslated क्षेत्र में पूरक साइटों के लिए बाध्यकारी हैं (3-UTR) लक्ष्य जीन के प्रोटीन अभिव्यक्ति को दबाने और mrna नीचा. परिमाणीकरण microRNAs जीन अभिव्यक्ति में मूल्यवान अंतर्दृष्टि दे सकते हैं और कई प्रोटोकॉल इस उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है3.
हम छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक परिभाषित, reproduible, और लंबे समय से चली आ रही प्रोटोकॉल विकसित किया है, और खुला स्रोत bioinformatics उपकरण का उपयोग कर सामान्यीकृत पढ़ता का विश्लेषण करने के लिए. महत्वपूर्ण बात यह है कि हमारे प्रोटोकॉल दोनों अंतर्जात microRNAs और exogenously दिया निर्माण है कि microRNA की तरह प्रजातियों का उत्पादन की एक साथ पहचान सक्षम बनाता है, जबकि कम से कम है कि अन्य छोटे आरएनए प्रजातियों के नक्शे पढ़ता है, रिबोसोमल आरएनए सहित ( आर.आर.एन.ए.), स्थानांतरण आरएनए व्युत्पन्न छोटे आरएनए (टीएसआरएन), दोहराने से व्युत्पन्न छोटे आरएनए, और एमआरएनए अवक्रमण उत्पाद। सौभाग्य से, microRNAs 5-फॉस्फोरीलेटा हुआ और2-3 हाइड्रॉक्सीलेटा 4, एक विशेषता है कि उन्हें इन अन्य छोटे RNAs और MRNA गिरावट उत्पादों से अलग leveraged किया जा सकता है. microRNA क्लोनिंग और अनुक्रमण है कि अक्सर तेज और मल्टीप्लेक्स के लिए आसान कर रहे हैं के लिए कई वाणिज्यिक विकल्प मौजूद हैं; हालांकि, किट अभिकर्मकों और उनके लगातार संशोधनों के स्वामित्व प्रकृति नमूना चुनौतीपूर्ण चलाता है की तुलना करता है. हमारी रणनीति acrylamide और agarose जेल शुद्धि कदम के माध्यम से microRNAs के केवल सही आकार इकट्ठा करने का अनुकूलन. इस प्रोटोकॉल में, हम भी अनुक्रम aligning के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन खुला स्रोत उपकरण का उपयोग microRNAs करने के लिए पढ़ता है. निर्देशों का यह सेट विशेष रूप से नौसिखिया informatics उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा, चाहे हमारे पुस्तकालय तैयारी विधि या एक वाणिज्यिक विधि प्रयोग किया जाता है की परवाह किए बिना.
इस प्रोटोकॉल कई प्रकाशित अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, इसका उपयोग उस तंत्र की पहचान करने के लिए किया गया था जिसके द्वारा डाइजर एंजाइम स्टेम-लूप संरचना के आंतरिक लूप से दो न्यूक्लिओटाइड की दूरी पर छोटे हेयरपिन आरएनए को छोड़ देता है – तथाकथित “लूप-काउंटिंग नियम”5। हम भी वितरित छोटे hairpin RNAs के रिश्तेदार बहुतायत की पहचान करने के लिए इन तरीकों का पालन किया (shRNA) रिकॉमबिनेंट एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर (rAAVs) से व्यक्त, shRNA अभिव्यक्ति की सीमा है कि जिगर से पहले सहन किया जा सकता की सीमा की पहचान करने के लिए अधिक shRNA अभिव्यक्ति के साथ जुड़े विषाक्तता6| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने यकृत में माइक्रोआरएन की भी पहचान की जो माइक्रोआरएनए-122 की अनुपस्थिति का जवाब देती है – एक अत्यधिक व्यक्त यकृत microRNA – जबकि इसमाइक्रोआरएनए 7 के निम्नीकरण पैटर्न की भी विशेषता है। क्योंकि हम कई प्रयोगों में लगातार हमारे प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, हम नमूना तैयारी longitudinally निरीक्षण करने में सक्षम किया गया है, और देखते हैं कि वहाँ कोई स्पष्ट बैच प्रभाव हैं.
इस प्रोटोकॉल साझा करने में, हमारा लक्ष्य उपयोगकर्ताओं को उच्च गुणवत्ता उत्पन्न करने के लिए सक्षम करने के लिए है, लगभग किसी भी ऊतक या सेल लाइन में microRNAs के reproduible परिमाणीकरण, सस्ती उपकरण और अभिकर्मकों का उपयोग कर, और मुक्त bioinformatics उपकरण.
Protocol
Representative Results
Discussion
20 साल पहले13से अधिक microRNAs की पहचान के बावजूद , microRNA अनुक्रमण की प्रक्रिया कठिन बनी हुई है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, नियमित रूप से घर में प्रोटोकॉल14अपनाने से प्रयोगशालाओं में बाधा . अन…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मार्गदर्शन और सुझावों के लिए एंड्रयू फायर और मार्क Kay की प्रयोगशालाओं के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| 100 bp DNA ladder | NEB | N3231 | |
| 19:1 bis-acrylamide | Millipore Sigma | A9926 | |
| 25 bp DNA step ladder | Promega | G4511 | |
| Acid phenol/chloroform | ThermoFisher | AM9720 | |
| Acrylamide RNA loading dye | ThermoFisher | R0641 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Biorad | 161-0700 | |
| Bioanalyzer instrument | Agilent | G2991AA | For assessing RNA quality and concentration |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Ethanol (100%) | Sigma | E7023 | |
| Gel Loading Buffer II | ThermoFisher | AM8547 | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM9516 | Blue color helps in visualizing pellet |
| HCl | Sigma | 320331 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Maxi Vertical Gel Box 20 x 20cm | Genesee | 45-109 | |
| miRVana microRNA isolation kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| miSeq system | Illumina | SY-410-1003 | For generating small RNA sequencing data |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Nusieve low-melting agarose | Lonza | 50081 | |
| Parafilm (laboratory sealing film) | Millipore Sigma | P7793 | |
| Poly-ethylene glycol 8000 | NEB | included with M0204 | |
| ProtoScript II First strand cDNA Synthesis Kit | NEB | E6560S | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher | Q33226 | For quantifying DNA concentration |
| Qubit RNA HS Assay kit | ThermoFisher | Q32855 | |
| Razor Blades | Fisher Scientific | 12640 | |
| Siliconized Low-Retention 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 02-681-331 | |
| T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | NEB | M0242S | |
| TapeStation | Agilent | G2939BA | For assessing RNA quality and concentration |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273X | |
| TEMED | Biorad | 161-0800 | |
| Tris Base pH 7.5 | Sigma | 10708976001 | |
| Tris-buffered EDTA | Sigma | T9285 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | |
| UltraPure Ethidium bromide (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Universal miRNA cloning linker | NEB | S1315S | |
| Urea | Sigma | U5378 |
Referências
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