लाइव सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी उपसेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण और बैक्टीरिया में सेल आकृति विज्ञान परिवर्तन की जांच करने के लिए
Summary
यह लेख प्रोटीन उप-कोशिकीय स्थानीयकरण गतिशीलता की जांच करने और बैसिलस सबटिलिस और स्टेफिलोकोकस ऑरियस में उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए एक कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करता है।
Abstract
कोशिका विभाजन और बैक्टीरिया में सेल आकार को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच आमतौर पर उच्च संकल्प फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में की जाती है क्योंकि जनसंख्या स्तर पर की गई टिप्पणियां वास्तव में प्रतिबिंबित नहीं हो सकती हैं कि एक ही कोशिका स्तर पर क्या होता है। लाइव-सेल टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी जांचकर्ताओं को सेल डिवीजन या सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तनों की निगरानी करने की अनुमति देती है जो प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण और जीन अभिव्यक्ति के समय के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जैसा कि ऐसा होता है, महत्वपूर्ण जैविक प्रश्नों का उत्तर देने में संभावित सहायता करने के लिए। यहां, हम एक उच्च संकल्प डेकोनोलुयूशन माइक्रोस्कोप का उपयोग करबैसिलस सबटिलिस और स्टेफिलोकोकस ऑरियस में फेनोटाइपिक परिवर्तनों की निगरानी करने के लिए अपने प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस रिपोर्ट का उद्देश्य एक सरल और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसे अन्य जांचकर्ताओं द्वारा बैक्टीरिया के साथ-साथ अन्य जीवों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के संचालन में रुचि रखते हैं ।
Introduction
बैक्टीरियल सेल बायोलॉजी के क्षेत्र में माइक्रोस्कोपी तकनीक 1,2में हाल की प्रगति से काफी बढ़ाया गया है । अन्य उपकरणों में, माइक्रोस्कोप जो टाइमलैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी प्रयोगों का संचालन करने में सक्षम हैं, एक मूल्यवान उपकरण बने हुए हैं। जांचकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -आधारित ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशनल रिपोर्टर फ्यूजन, फ्लोरोसेंट डी-अमीनो एसिड (एफडीएए)3का उपयोग करके वास्तविक समय में विभिन्न शारीरिक घटनाओं की निगरानी कर सकते हैं, या सेल वॉल, झिल्ली और डीएनए को लेबल करने के लिए अन्य दाग का उपयोग कर सकते हैं। इसलिए यह कोई आश्चर्य की बात नहीं है कि फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल जीवविज्ञानियों के बीच लोकप्रिय बनी हुई है । बस अंत फेनोटाइप दिखाने के अलावा, यह जानकारी प्रदान करते हैं कि टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखे गए फेनोटाइप कैसे उत्पन्न होते हैं, निष्कर्षों में महत्वपूर्ण मूल्य जोड़ सकते हैं और संभावित रूप से सुराग प्रदान करते हैं कि संभावित दवा उम्मीदवारों द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को क्या लक्षित किया जा रहाहै।
एक पूरी तरह से मोटर चालित, उल्टे, चौड़े क्षेत्र फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर उच्च संकल्प इमेजिंग का संचालन करने के लिए प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिकादेखें) इस लेख में प्रदान किए गए हैं । इन प्रोटोकॉलों को अन्य फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप की जरूरतों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है जो टाइमलैप्स माइक्रोस्कोपी आयोजित करने में सक्षम हैं। यद्यपि यहां चर्चा किए गए सॉफ़्टवेयर विशिष्ट निर्माता-आपूर्ति किए गए सॉफ़्टवेयर से मेल खाता है जैसा कि सामग्री की तालिकामें इंगित किया गया है, आमतौर पर अन्य माइक्रोस्कोप निर्माताओं या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध इमेजजे5द्वारा आपूर्ति किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर में माइक्रोस्कोपी डेटा का विश्लेषण करने के लिए समकक्ष उपकरण हैं। उन स्थितियों के लिए जहां टाइमलैप्स अनुकूल नहीं है, इस लेख में वर्णित समय-पाठ्यक्रम प्रयोग किए जा सकते हैं। बी सबटिलिस और एस ऑरियस: यहां वर्णित प्रोटोकॉल दो अलग-अलग बैक्टीरियल प्रजातियों में फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत गाइड प्रदान करते हैं। उपयोग किए जाने वाले उपभेदों के लिए टेबल 1 देखें।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोबायोमाइक्रोयल जीवों से संबंधित अध्ययनों में एक मुख्य आधार बना हुआ है। उनके माइक्रोन-स्केल सेल आकार को देखते हुए, एकल सेल स्तर के अध्ययनों ने पारंपरिक रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) पर भ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस लेख पर उनकी टिप्पणी के लिए हमारे प्रयोगशाला सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को यूनिवर्सिटी ऑफ साउथ फ्लोरिडा (पीई) से स्टार्ट-अप ग्रांट से फंड दिया गया था ।
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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