Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor
Summary
Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.
Abstract
Los movimientos oculares precisos son cruciales para la visión, pero el desarrollo del sistema motor ocular, especialmente las vías moleculares que controlan la orientación de axón, no ha sido completamente aclarado. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas de los ensayos tradicionales de orientación de axón. Para identificar señales adicionales de guía de axón que influyen en el nervio oculomotor, se desarrolló un ensayo de rebanada ex vivo para imaginar el nervio oculomotor en tiempo real a medida que crece hacia el ojo. E10.5 Los embriones IslMN-GFP se utilizan para generar rodajas ex vivo incrustándolas en agarosa, cortando en un vibratomo, luego creándolas en una incubadora de microscopio con fotomicroscopía de lapso de tiempo para 24-72 h. Rebanadas de control recapituladas el momento in vivo del crecimiento de los axónes desde el núcleo hasta la órbita. Se pueden añadir inhibidores de moléculas pequeñas o proteínas recombinantes a los medios de cultivo para evaluar el papel de las diferentes vías de orientación de axón. Este método tiene las ventajas de mantener más del microambiente local a través del cual atraviesan los axones, no axotomizar los axons en crecimiento, y evaluar los axons en múltiples puntos a lo largo de su trayectoria. También puede identificar efectos en subconjuntos específicos de axones. Por ejemplo, la inhibición de CXCR4 hace que los axones todavía dentro del cerebro medio crezcan dorsalmente en lugar de ventralmente, pero los axones que ya han salido ventralmente no se ven afectados.
Introduction
El sistema de motor ocular proporciona un sistema elegante para investigar los mecanismos de orientación de axón. Es relativamente sencillo, que consiste en tres nervios craneales que inervian seis músculos extraoculares (EOM) que mueven el ojo, y el levator palpebrae superioris (LPS) que levanta el párpado. El nervio oculomotor incuba el LPS y cuatro EOM – el oblicuo inferior y los músculos medial, inferior, y superior recto. Los otros dos nervios, el trochlear y los abducens, cada uno de ellos sólo inervate un músculo, el músculo oblicuo superior y el músculo recto lateral, respectivamente. Los movimientos oculares proporcionan una lectura fácil, que muestra si la inervación era apropiada, faltaba o era aberrante. Además, hay trastornos del movimiento ocular humano que resultan de déficits en el desarrollo neuronal o guía de axón, colectivamente llamados los trastornos congénitos de disinnervación craneal (CCDD)1.
A pesar de estas ventajas, el sistema motor ocular rara vez se utiliza en los estudios de orientación de axón2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, debido a inconvenientes técnicos. Los ensayos de orientación axón in vitro tienen muchas desventajas11. Los ensayos de cocultivo, en los que los explantes neuronales se cultivan junto con explantas de tejido objetivo12 o células transfectóte13,dependen tanto de la simetría del explantar como del posicionamiento preciso entre el tejido explanteo y el tejido diana. Ensayos de rayas14,15, en los que se establecen dos señales en franjas alternas y los axones se evalúan para un crecimiento preferencial en una franja, sólo indican que un sustrato es preferible al otro, no que cualquiera de los dos sea atractivo repulsivo, o fisiológicamente relevante. Las cámaras de microfluidos pueden formar gradientes químicos precisos, pero sujeto a axones en crecimiento a tensión de cizallamiento16,17,18, que pueden afectar su crecimiento. Además, en cada uno de estos enfoques, la recolección de explantas o células disociadas requiere que los axons de crecimiento superior sean axotomizados y, por lo tanto, estos ensayos examinan realmente la regeneración de axón, en lugar del crecimiento inicial del axón. Por último, estos enfoques in vitro eliminan el microambiente que influye en los axones y sus respuestas a las señales a lo largo de diferentes puntos de su curso, y tradicionalmente sólo prueban una señal de forma aislada. Al componer estas desventajas, el pequeño tamaño de cada núcleo en el sistema motor ocular hace que la disección sea técnicamente difícil para explantas o cultivos disociados. Además, los cultivos primarios de las neuronas motoras oculares suelen ser heterogéneos, tienen muerte celular significativa y dependen de la densidad, lo que requiere la agrupación de células de múltiples embriones (Ryosuki Fujiki, comunicación personal). Los métodos in vivo, sin embargo, incluyendo modelos de ratón knockout, son inapropiados para su uso para la detección, dado el tiempo y los gastos requeridos.
Los métodos desarrollados para cultivar embriones enteros19 permiten el etiquetado de células migratorias20 o bloqueo de moléculas específicas21,pero los cultivos de embriones enteros requieren incubación en botellas de rodillos que impide la toma de imágenes en tiempo real de las etiquetas Estructuras. También son posibles las técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación del embrión y luego el posterior desarrollo posterior, ya sea en el útero o en el abdomen de la madre (manteniendo la conexión placentaria)22, pero tampoco permiten lapso de tiempo Imagen.
Para superar los obstáculos de los ensayos in vitro y permitir un cribado rápido de las vías de señalización, se desarrolló una técnica de cultivo de rodajas embrionarias ex vivo23,adaptada de un protocolo previamente publicado para el crecimiento del nervio periférico24. Usando este protocolo, el nervio oculomotor en desarrollo se puede imaginar con el tiempo en presencia de muchas de las estructuras circundantes a lo largo de su trayectoria, incluyendo objetivos de la MOE. Mediante la adición de inhibidores de moléculas pequeñas, factores de crecimiento o señales de orientación a los medios de cultivo, podemos evaluar perturbaciones de orientación en múltiples puntos a lo largo de la trayectoria del axón, permitiendo una evaluación más rápida del crecimiento potencial y los factores de orientación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de cultivo de rebanadas ex vivo proporciona ventajas significativas sobre los ensayos de orientación de axón tradicionales23. El tamaño de cada núcleo motor craneal no es un factor limitante, y no es necesaria una disección difícil. Se mantiene el microambiente endógeno a través del cual viajan los axones, permitiendo la modificación de una vía de señalización manteniendo otras vías de señalización. Además, los efectos se pueden evaluar en diferentes puntos a lo larg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiación proporcionada por el Instituto Nacional del Ojo [5K08EY027850], Instituto Nacional de Salud y Desarrollo Infantil [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], y la Fundación de Oftalmología del Hospital Infantil [Faculty Discovery Award]. ECE es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Referências
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