السابق فيفو أوكولوموتور شريحة الثقافة من الفئران الجنينية GFP التعبير عن التصوير الفاصل الزمني من نمو الأعصاب أوكولوموتور
Summary
يسمح فحص شريحة الجسم الحي السابق بالتصوير في الوقت الحقيقي. يتم إنشاء شرائح عن طريق تضمين E10.5 IslMN: GFP الأجنة في agarose، وتقطيع على الاهتزاز، وتنمو في حاضنة المرحلة العليا. يتم تقييم دور مسارات توجيه axon عن طريق إضافة مثبطات إلى وسائل الإعلام الثقافية.
Abstract
حركات العين دقيقة حاسمة للرؤية، ولكن تطوير نظام المحرك العين، وخاصة المسارات الجزيئية التي تسيطر على توجيه محور عصبي، لم يتم توضيحها بشكل كامل. ويرجع ذلك جزئياً إلى القيود التقنية على الاختبارات التقليدية لتوجيهات المحاور. لتحديد إشارات توجيه axon إضافية تؤثر على العصب oculomotor، تم تطوير اختبار شريحة الجسم الحي السابق لتصوير العصب الحركي في الوقت الحقيقي كما ينمو نحو العين. E10.5 يتم استخدام الأجنة Isl MN-GFP لتوليد شرائح الجسم الحي السابق عن طريق تضمينها في أغاروز، وتقطيعها على الاهتزاز، ثم زراعتها في حاضنة مجهر المرحلة أعلى مع التصوير المجهري الفاصل الزمني لمدة 24-72 ح. في توقيت الجسم الحي من نمو المحاور من النواة إلى المدار. يمكن إضافة مثبطات الجزيئات الصغيرة أو البروتينات المؤتلفة إلى وسائل الإعلام الثقافية لتقييم دور مسارات توجيه المحاور المختلفة. هذه الطريقة لديها مزايا الحفاظ على المزيد من البيئة الدقيقة المحلية التي من خلالها المحاور اجتياز، وليس الساكسوتوميس المحاور المتنامية، وتقييم المحاور في نقاط متعددة على طول مسارها. كما يمكن أن تحدد الآثار على مجموعات فرعية محددة من المحاور. على سبيل المثال، تثبيط CXCR4 يسبب المحاور لا تزال داخل الدماغ المتوسط لتنمو الظهرية بدلا من فينرالي، ولكن لا تتأثر المحاور التي خرجت بالفعل ventrally.
Introduction
يوفر نظام المحرك العيني نظام أنيق للتحقيق في آليات توجيه أكسون. وهو غير معقد نسبيا، ويتألف من ثلاثة أعصاب الجمجمة innervating ستة عضلات خارج العين (EOMs) التي تحرك العين، وlevator palpebrae superioris (LPS) الذي يرفع الجفن. العصب الحركي الداخلي LPS وأربعة EOMs – المائل السفلي والعضلات الوسيطة، السفلي، والمستقيمة متفوقة. أما الأعصاب الأخرى، وهي التروكلير وعبدهسين، فكل منهما يُعد عضلة واحدة فقط، وعضلة مستقيمة مائلة وجانبية متفوقة، على التوالي. توفر حركات العين قراءة سهلة، تظهر ما إذا كان التداخلي مناسبًا أو مفقودًا أو شاذًا. بالإضافة إلى ذلك، هناك اضطرابات حركة العين البشرية التي تنتج عن العجز في تطوير الخلايا العصبية أو توجيه axon، ويطلق عليها مجتمعة اضطرابات التأذيب القحفي الخلقية (CCDDs)1.
على الرغم من هذه المزايا، ونادرا ما يستخدم نظام السيارات العين في الدراسات التوجيهية axon2،3،4،5،6،7،8، 9 , 10، وذلك بسبب العيوب التقنية. في المختبر axon التوجيه الاختبارات لديها العديد من العيوب11. اختبار الثقافة المشتركة، التي يتم فيها زراعة explants الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع explants من الأنسجة المستهدفة12 أو الخلايا المنقولة13، تعتمد على كل من التماثل من explant وتحديد المواقع دقيقة بين explant والأنسجة المستهدفة. شريط الاختبارات14،15، التي يتم وضع اثنين من العظة في المشارب بالتناوب ويتم تقييم المحاور للنمو التفضيلي على شريط واحد، تشير فقط إلى أن الركيزة واحدة هي الأفضل من الأخرى، وليس أن أي منهما جذابة أو مثير للاشمئزاز، أو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. غرف Microfluidics يمكن أن تشكل التدرجات الكيميائية الدقيقة، ولكن موضوع المحاور المتنامية لالقص الإجهاد16،17،18، والتي يمكن أن تؤثر على نموها. وعلاوة على ذلك، في كل من هذه النهج، يتطلب جمع النباتات الخارجية أو الخلايا المفككة أن تكون المحاور المتناجة، وبالتالي فإن هذه الاختبارات تدرس في الواقع تجديد أكسون، بدلاً من نمو المحاور الأولي. وأخيراً، فإن هذه النُهُج في المختبر تزيل البيئة الدقيقة التي تؤثر على المحاور واستجاباتها للإشارات على امتداد نقاط مختلفة من مسارها، وتختبر عادة إشارة واحدة فقط في عزلة. ومما يضاعف من هذه العيوب، أن صغر حجم كل نواة في نظام المحرك العيني يجعل التشريح صعباً من الناحية التقنية إما بالنسبة للنباتات المنقطعة أو الثقافات المفككة. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحركية العينية عادة ما تكون غير متجانسة، لديها موت خلايا كبير، وتعتمد على الكثافة، مما يتطلب تجميع الخلايا من أجنة متعددة (Ryosuki Fujiki، الاتصال الشخصي). في طرق الجسم الحي، ومع ذلك، بما في ذلك نماذج الماوس خروج المغلوب، غير مناسبة للاستخدام للفحص، نظرا للوقت والنفقات المطلوبة.
الطرق التي تم تطويرها لثقافة الأجنة الكاملة19 تسمح بوسم الخلايا المهاجرة20 أو حصار جزيئات محددة21، ولكن الثقافات الجنينية كلها تتطلب الحضانة في زجاجات الأسطوانة التي تحول دون التصوير في الوقت الحقيقي من المسمى الهياكل. التقنيات الجراحية التي تسمح بالتلاعب في الجنين ومن ثم مزيد من التطور اللاحق إما في الرحم أو في بطن الأم (الحفاظ على اتصال المشيمة)22 ممكنة أيضا، ولكن هذه أيضا لا تسمح بفاصل زمني التصوير.
للتغلب على العقبات من الاختبارات في المختبر والسماح بالفحص السريع لمسارات الإشارات، تم تطوير تقنية ثقافة الشريحة الجنينية من الجسم الحي السابق23، مقتبسة من بروتوكول نشر سابقا لنمو الأعصاب المحيطية24. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تصوير العصب الحركي النامي مع مرور الوقت في وجود العديد من الهياكل المحيطة على طول مساره، بما في ذلك أهداف EOM. من خلال إضافة مثبطات جزيء صغير، وعوامل النمو، أو العظة التوجيه إلى وسائل الإعلام الثقافة، يمكننا تقييم الاضطرابات التوجيه في نقاط متعددة على طول مسار محور محور محور، مما يسمح بتقييم أسرع للنمو المحتمل ة وعوامل التوجيه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول ثقافة شريحة الجسم الحي السابق مزايا كبيرة على الاختبارات التوجيه axon التقليدية23. حجم كل نواة المحرك القحفي ليس عاملا ً مقيداً، وليس من الضروري إجراء تشريح صعب. البيئة الدقيقة الذاتية التي يتم من خلالها الحفاظ على مسارات المحاور، مما يسمح بتعديل مسار إشارة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل المقدم من المعهد الوطني للعيون [5K08EY027850]، المعهد الوطني لصحة الطفل ونمائه [U54HD090255]، برنامج هارفارد فيجن لتطوير العلماء السريريين [5K12EY016335]، مؤسسة فرسان تمبلر للعيون [بداية مهنية] منحة] ومؤسسة طب العيون في مستشفى الأطفال [جائزة اكتشاف الكلية]. اللجنة الاقتصادية لأوروبا هو محقق معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Referências
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia do Desenvolvimento. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia do Desenvolvimento. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
