Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth
Summary
Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.
Abstract
Genaue Augenbewegungen sind entscheidend für das Sehen, aber die Entwicklung des Okularmotoriksystems, insbesondere der molekularen Bahnen, die die Axonführung steuern, wurde noch nicht vollständig aufgeklärt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen traditioneller Axon-Leitfaden-Assays zurückzuführen. Um zusätzliche Axon-Leitlinien zu identifizieren, die den okulomotorischen Nerv beeinflussen, wurde ein ex vivo-Slice-Assay entwickelt, um den okulomotorischen Nerv in Echtzeit abzubilden, während er zum Auge heranwächst. E10.5 IslMN-GFP-Embryonen werden verwendet, um ex vivo Scheiben zu erzeugen, indem sie in Agarose eingebettet werden, auf ein Vibratome schneiden und sie dann in einem Mikroskop-Bühnen-Top-Inkubator mit Zeitraffer-Photomikroskopie für 24-72 h anbauen. das in vivo Timing des Auswachsens von Axonen vom Kern in die Umlaufbahn. Kleine Molekülinhibitoren oder rekombinante Proteine können den Kulturmedien hinzugefügt werden, um die Rolle verschiedener Axon-Führungswege zu bewerten. Diese Methode hat die Vorteile, mehr von der lokalen Mikroumgebung zu erhalten, durch die Axone durchqueren, nicht die wachsenden Axone axotomisieren und die Axone an mehreren Punkten entlang ihrer Flugbahn bewerten. Es kann auch Effekte auf bestimmte Teilmengen von Axonen identifizieren. Zum Beispiel führt die Hemmung von CXCR4 dazu, dass Axone, die sich noch innerhalb des Mittelhirns befinden, eher dorsal als ventral wachsen, aber Axone, die bereits ventral ausgetreten sind, sind nicht betroffen.
Introduction
Das Augenmotorsystem bietet ein elegantes System zur Untersuchung von Axon-Führungsmechanismen. Es ist relativ unkompliziert, bestehend aus drei Hirnnerven, die sechs extraokulare Muskeln (EOMs) innervieren, die das Auge bewegen, und dem Levator palpebrae superioris (LPS), der das Augenlid hebt. Der okulomotorische Nerv innerviert die LPS und vier EOMs – die unterlegene Schräglage und die mediale, minderwertige und überlegene Rectusmuskulatur. Die anderen beiden Nerven, die Trochlea und abducens, jeder nur innervate einen Muskel, die überlegene schräge und seitliche Rectus-Muskel, jeweils. Augenbewegungen bieten eine einfache Anzeige, zeigt, ob Innervation angemessen, fehlt oder abwegig war. Darüber hinaus gibt es menschliche Augenbewegungsstörungen, die aus Defiziten in der neuronalen Entwicklung oder Axonführung resultieren, kollektiv als die angeborenen Schädel-Disinnervationsstörungen (CCDDs)1bezeichnet.
Trotz dieser Vorteile wird das Augenmotorsystem selten in Axon-Leitstudien 2 ,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, aufgrund technischer Nachteile. In-vitro-Axon-Leitlinien-Assays haben viele Nachteile11. Co-Kultur-Assays, bei denen neuronale Explanten zusammen mit Explanten des Zielgewebes12 oder transfizierter Zellen13kultiviert werden, hängen sowohl von der Symmetrie des Explantations- als auch der präzisen Positionierung zwischen Explantation und Zielgewebe ab. Streifenassays14,15, in denen zwei Hinweise in abwechselnden Streifen und Axonen auf bevorzugtes Wachstum auf einem Streifen festgelegt sind, deuten nur darauf hin, dass ein Substrat dem anderen vorzuziehen ist, nicht, dass beide attraktiv sind. abstoßend oder physiologisch relevant. Mikrofluidikkammern können präzise chemische Gradienten bilden, aber wachsende Axone der Scherspannung16,17,18, unterziehen, die ihr Wachstum beeinflussen können. Darüber hinaus erfordert das Sammeln von Explanten oder dissoziierten Zellen bei jedem dieser Ansätze, dass auswachsende Axone axotomisiert werden, und daher untersuchen diese Assays tatsächlich die Axonregeneration und nicht das anfängliche Axonwachstum. Schließlich entfernen diese In-vitro-Ansätze die Mikroumgebung, die Axone und ihre Reaktionen auf Hinweise entlang verschiedener Punkte ihres Kurses beeinflusst, und testen traditionell nur einen Hinweis isoliert. Zusammen mit diesen Nachteilen stellt die geringe Größe jedes Kerns im Augenmotorsystem die Zerlegung für Explanten oder dissoziierte Kulturen technisch eine Herausforderung dar. Darüber hinaus sind Primärkulturen von okularen motorischen Neuronen in der Regel heterogen, haben einen signifikanten Zelltod und sind dichteabhängig, was eine Zusammenlegung von Zellen aus mehreren Embryonen erfordert (Ryosuki Fujiki, persönliche Kommunikation). In-vivo-Methoden, einschließlich Knockout-Maus-Modelle, sind jedoch angesichts der Zeit und des Erforderlichen für das Screening ungeeignet für das Screening.
Methoden, die entwickelt wurden, um ganze Embryonen zu kultivieren19 ermöglichen die Kennzeichnung von wandernden Zellen20 oder die Blockade bestimmter Moleküle21, aber ganze Embryokulturen erfordern eine Inkubation in Rollenflaschen, was eine Echtzeit-Bildgebung von markierten Strukturen. Chirurgische Techniken, die eine Manipulation des Embryos und anschließende Weiterentwicklung entweder in der Gebärmutter oder im Bauch der Mutter (Aufrechterhaltung der Plazentaverbindung)22 ermöglichen, erlauben aber auch keinen Zeitraffer Imaging.
Um die Hindernisse von In-vitro-Assays zu überwinden und ein schnelles Screening von Signalwegen zu ermöglichen, wurde eine ex vivo embryonale Scheibenkulturtechnik entwickelt23, angepasst an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für peripheres Nervenwachstum24. Mit diesem Protokoll kann der sich entwickelnde okulomotorische Nerv im Laufe der Zeit in Gegenwart vieler der umgebenden Strukturen entlang seiner Flugbahn abgebildet werden, einschließlich EOM-Ziele. Durch Hinzufügen kleiner Molekülinhibitoren, Wachstumsfaktoren oder Leitfäden zu den Kulturmedien können wir Die Orientierungsstörungen an mehreren Punkten entlang des Axonverlaufs bewerten und so eine schnellere Bewertung potenzieller Wachstums- und Orientierungsfaktoren ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses ex vivo Slice Culture-Protokoll bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Axon-Leitlinien-Assays23. Die Größe jedes Kranialmotorkerns ist kein begrenzender Faktor, und eine schwierige Zerlegung ist nicht erforderlich. Die endogene Mikroumgebung, durch die die Axone wandern, ermöglicht die Änderung eines Signalwegs unter Beibehaltung anderer Signalwege. Darüber hinaus können Effekte an verschiedenen Punkten entlang der Axonbahn bewertet werden. Da axon guidance mehrere Cues …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzierung durch das National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], die Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Stipendium] und die Children es Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Referências
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia do Desenvolvimento. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia do Desenvolvimento. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
