Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth
Summary
Un test etta ex vivo permette di immaginare l’escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.
Abstract
Movimenti accurati degli occhi sono cruciali per la visione, ma lo sviluppo del sistema motorio oculare, in particolare le vie molecolari che controllano la guida degli assi, non è stato completamente chiarito. Ciò è in parte dovuto ai limiti tecnici dei tradizionali saggi di orientamento degli assoni. Per identificare ulteriori segnali di guida ascia che influenzano il nervo oculomotore, è stato sviluppato un saggio ex vivo per immaginare il nervo oculomotore in tempo reale man mano che cresce verso l’occhio. Gli embrioni E10.5 IslMN-GFP vengono utilizzati per generare fette ex vivo incorporandole in agarose, tagliandole su un vibratoma, per poi coltivarle in un’incubatrice a stadio al microscopio con fotomicroscopia time-lapse per 24-72 h. Le fette di controllo riassumono il ricapitolare il tempismo in vivo della crescita degli assoni dal nucleo all’orbita. Gli inibitori delle piccole molecole o le proteine ricombinanti possono essere aggiunti ai mezzi di coltura per valutare il ruolo dei diversi percorsi di guida degli assoni. Questo metodo ha i vantaggi di mantenere più del microambiente locale attraverso il quale gli assoni attraversano, non assiomizzando gli assoni in crescita e valutando gli assoni in più punti lungo la loro traiettoria. Può anche identificare gli effetti su specifici sottoinsiemi di assoni. Ad esempio, l’inibizione di CXCR4 fa sì che gli assoni ancora all’interno del midbrain crescano dorsalmente piuttosto che ventralmente, ma gli assoni che sono già usciti dal ventralsi non sono interessati.
Introduction
Il sistema motore oculare fornisce un elegante sistema per studiare i meccanismi di guida degli assoni. È relativamente semplice, costituito da tre nervi cranici che innervadono sei muscoli extraoculari (EOM) che muovono l’occhio, e la superiorità levatore palpebra (LPS) che solleva la palpebra. Il nervo oculomotore innerva l’LPS e quattro EOM – i muscoli obliqui inferiori e mediali, inferiori e superiori. Gli altri due nervi, il trochlear e l’abducens, ognuno solo innervare un muscolo, il superiore obliquo e muscolo di retto laterale, rispettivamente. I movimenti oculari forniscono una facile lettura, mostrando se l’innervazione era appropriata, mancante o aberranti. Inoltre, ci sono disturbi del movimento dell’occhio umano che derivano da deficit nello sviluppo neuronale o guida assone, collettivamente chiamato i disturbi didisinnervazione cranica congeniti (CCDD)1.
Nonostante questi vantaggi, il sistema motorio oculare è raramente utilizzato negli studi di guida degli assoni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10, a causa di inconvenienti tecnici. I saggi di guida assoni in vitro hanno molti svantaggi11. I saggi di co-coltura, in cui gli espiante neuronali vengono coltivati insieme agli espianti del tessuto bersaglio12 o delle cellule trasfette13, dipendono sia dalla simmetria dell’espianto che dal posizionamento preciso tra l’espianto e il tessuto bersaglio. I saggi Striscia14,15, in cui due spunti sono disposti a strisce alternate e gli assoni sono valutati per la crescita preferenziale su una striscia, indicano solo che un substrato è preferibile all’altro, non che uno dei due sia attraente o ripugnante, o fisiologicamente rilevante. Le camere microfluidiche possono formare precisi gradienti chimici, ma soggetti a picconi in crescita per inclinare lo stress di taglio16,17,18, che possono influenzare la loro crescita. Inoltre, in ciascuno di questi approcci, la raccolta di espianti o cellule dissociate richiede che gli assoni in crescita in crescita siano assitopi e quindi questi saggi esaminino effettivamente la rigenerazione degli assoni, piuttosto che la crescita iniziale degli assoni. Infine, questi approcci in vitro rimuovono il microambiente che influenza gli assoni e le loro risposte ai segnali lungo diversi punti del loro corso, e tradizionalmente testano solo un segnale in isolamento. A complicare questi svantaggi, le piccole dimensioni di ogni nucleo nel sistema motorio oculare rendono la dissezione tecnicamente difficile per gli espianti o per le colture dissociate. Inoltre, le colture primarie di motoneuroni oculari sono di solito eterogenee, hanno una morte cellulare significativa e dipendono dalla densità, richiedendo il raggruppamento di cellule da embrioni multipli (Ryosuki Fujiki, comunicazione personale). I metodi in vivo, tuttavia, compresi i modelli di topo a foratura, sono inappropriati da utilizzare per lo screening, dati i tempi e le spese richiesti.
Metodi sviluppati per la coltura di embrioni interi19 consentono l’etichettatura delle cellule migratorie20 o il blocco di molecole specifiche21, ma le colture intere embrionali richiedono incubazione in bottiglie a rulli che preclude l’imaging in tempo reale di etichettato Strutture. Sono possibili anche tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione dell’embrione e il successivo ulteriore sviluppo sia nell’utero che nell’addome della madre (mantenendo la connessione placentare)22, ma anche queste non consentono il time-lapse Imaging.
Per superare gli ostacoli dei saggi in vitro e consentire uno screening rapido dei percorsi di segnalazione, è stata sviluppata una tecnica di coltura a fette embrionale ex vivo23, adattata da un protocollo precedentemente pubblicato per la escrescenza del nervo periferico24. Utilizzando questo protocollo, il nervo oculomotore in via di sviluppo può essere immaginato nel tempo in presenza di molte delle strutture circostanti lungo la sua traiettoria, compresi gli obiettivi dell’oOM. Aggiungendo inibitori di piccole molecole, fattori di crescita o indicazioni guida ai media di coltura, possiamo valutare le perturbazioni di orientamento in più punti lungo la traiettoria dell’assone, consentendo una valutazione più rapida dei potenziali fattori di crescita e di guida.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo di coltura delle fette ex vivo offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali indicazioni degli assoni23. La dimensione di ogni nucleo motorio cranico non è un fattore limitante, e non è necessaria alcuna dissezione difficile. Il microambiente endogeno attraverso il quale gli assoni viaggiano, consentendo la modifica di un percorso di segnalazione pur mantenendo altri percorsi di segnalazione. Inoltre, gli effetti possono essere valutati in punti diversi lungo la traie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamenti forniti dal National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], e la Children’s Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE è un investigatore dell’Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Referências
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