Ex vivo Oculomotor slice kultur från embryonala GFP-uttrycker möss för tidsförlopp avbildning av Oculomotor nerv utväxt
Summary
En ex vivo slice-analys kan ögonmuskelförlamningar nerv utväxt att avbildas i realtid. Skivor genereras genom att bädda in E 10.5 ISLmn: GFP embryon i aguppstod, skivning på en vibratome, och växer i en scen-Top inkubator. Rollen för Axon väglednings vägar bedöms genom att lägga till hämmare till kulturen media.
Abstract
Noggranna ögonrörelser är avgörande för synen, men utvecklingen av det okulära motorsystemet, särskilt de molekylära vägar som styr Axon-vägledningen, har inte helt klarlagts. Detta beror delvis på tekniska begränsningar av traditionella Axon väglednings analyser. För att identifiera ytterligare Axon vägledning signaler som påverkar ögon muskelmage, en ex vivo slice-analys för att avbilda den ögonmuskelförlamningar nerv i realtid som den växer mot ögat utvecklades. E 10.5 ISLmn-GFP embryon används för att generera ex vivo skivor genom att bädda in dem i aguppstod, skivning på en vibratome, sedan odla dem i ett Mikroskop skede-Top inkubator med tidsfördröjning photomicroscopy för 24-72 h. återför kontroll skivor recapitulate in vivo tidpunkten för utväxt av axoner från kärnan till omloppsbanan. Småmolekylära hämmare eller rekombinanta proteiner kan läggas till i kulturmedia för att bedöma vilken roll olika Axon väglednings vägar har. Denna metod har fördelarna med att upprätthålla mer av den lokala mikromiljön genom vilken axoner Traverse, inte axotomizing den växande axoner, och bedöma axonerna på flera punkter längs deras bana. Det kan också identifiera effekter på specifika undergrupper av axoner. Till exempel, hämning av CXCR4 orsakar axoner fortfarande inom mellanhjärnan att växa dorsalt snarare än ventralt, men axoner som redan har lämnat ventralt påverkas inte.
Introduction
Det okulära motorsystemet ger ett elegant system för att undersöka Axon vägledningssystem. Det är relativt okomplicerat, bestående av tre kraniala nerver innervating sex extraokulära muskler (EOMs) som flyttar ögat, och levator palpebraesuperior superioris (LPS) som lyfter ögonlocket. Den ögonmuskelförlamningar nerv innerverar LPS och fyra eoms-sämre sned och den mediala, sämre och överlägsen rectus muskler. De andra två nerver, den trochlear och abducens, var enda innerverar en muskel, den överlägsna sneda och laterala rectus muskler, respektive. Ögonrörelser ger en lätt avläsning, visar om innervation var lämpligt, saknas, eller avvikande. Dessutom, det finns mänskliga ögat rörelsestörningar som beror på underskott i neuronala utveckling eller Axon vägledning, kollektivt kallas den medfödda kraniala desinnervation störningar (CCDDs)1.
Trots dessa fördelar används okulärt motorsystem sällan i Axon väglednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, på grund av tekniska nackdelar. In vitro Axon väglednings analyser har många nackdelar11. Co-Culture analyser, där neuronala djur odlas tillsammans med djur av målvävnad12 eller transfekterade celler13, bero på både symmetri explantat och exakt positionering mellan explantat och målvävnad. Stripe-analyser14,15, där två ledtrådar är fastställda i alternerande ränder och axoner bedöms för preferens tillväxt på en rand, endast ange att ett substrat är att föredra framför den andra, inte att antingen är attraktiv eller repulsive, eller fysiologiskt relevanta. Mikrofluidik kammare kan bilda exakta kemiska gradienter, men ämne växande axoner till skjuvning stress16,17,18, vilket kan påverka deras tillväxt. Dessutom, i var och en av dessa metoder, samla in djur eller dissocierade celler kräver att outgrowing axoner vara axotomized och därmed dessa analyser faktiskt undersöka Axon förnyelse, snarare än initial Axon utväxt. Slutligen, dessa in vitro-metoder bort mikromiljön som påverkar axoner och deras svar på ledtrådar längs olika punkter i deras kurs, och traditionellt bara testa en cue i isolering. Compounding dessa nackdelar, gör den lilla storleken på varje kärna i den okulära motorsystemet dissektion tekniskt utmanande för antingen djur eller dissocierade kulturer. Dessutom, primära kulturer av okulära motoriska nervceller är vanligtvis heterogena, har betydande celldöd, och är densitet beroende, kräver sammanslagning av celler från flera embryon (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, men inklusive knockout musmodeller, är olämpliga att använda för screening, med tanke på den tid och kostnader som krävs.
Metoder som utvecklats för att odla hela embryon19 Tillåt märkning av flyttande celler20 eller blockad av specifika molekyler21, men hela embryokulturer kräver inkubering i rullflaskor som utesluter realtids avbildning av märkta Strukturer. Kirurgiska tekniker som möjliggör manipulation av embryot och sedan senare vidareutveckling antingen i livmodern eller i buken av mamman (upprätthålla placenta anslutning)22 är också möjliga, men dessa inte heller tillåter tidsfördröjning Imaging.
För att övervinna hindren för in vitro-analyser och möjliggöra snabb screening av signalering vägar, en ex vivo embryonal slice kultur teknik utvecklades23, anpassad från ett tidigare publicerat protokoll för perifer nervutväxt24. Med hjälp av detta protokoll, utveckla ögon muskel nerven kan avbildas över tid i närvaro av många av de omgivande strukturerna längs dess bana, inklusive EOM mål. Genom att lägga till små molekyler hämmare, tillväxtfaktorer, eller vägledning signaler till kulturen media, kan vi bedöma vägledning störningar på flera punkter längs Axon bana, vilket möjliggör en snabbare bedömning av potentiella tillväxt och väglednings faktorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta ex vivo slice kultur protokoll ger betydande fördelar jämfört med traditionella Axon väglednings analyser23. Storleken på varje kranialmotorisk kärna är inte en begränsande faktor, och ingen svår dissektion är nödvändig. Den endogena mikromiljön genom vilken axonerna färdas bibehålls, vilket möjliggör modifiering av en signalväg samtidigt som andra signaleringsvägar bibehålls. Dessutom kan effekter bedömas vid olika tidpunkter längs Axon-banan. Eftersom Axon vägledning…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering som tillhandahålls av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk vetenskapsman Development program [5K12EY016335], Tempelherreorden Eye Foundation [karriär starter Grant], och Children ‘ s Hospital oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE är Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
Referências
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Biologia do Desenvolvimento. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Biologia do Desenvolvimento. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
