आरएनए के पैरों के निशान की पहचान: TANDEM में आरएनए इम्यूनोएरिफ़िएसिस के माध्यम से प्रोटीन कॉम्प्लेक्स अनुक्रमण द्वारा पीछा किया (RIPIT-सेक)
Summary
यहाँ, हम अंतर्जात आरएनए बाध्यकारी साइटों या आरएनए के “फुटप्रिंट” को समृद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत: प्रोटीन (आरएनपी) स्तनधारी कोशिकाओं से परिसरों. इस दृष्टिकोण में आरएनपी उपइकाइयों के दो इम्यूनोवेरिफ़िएंस शामिल हैं और इसलिए इसे अग्रानुक्रम (आरआईपीटी) में आरएनए इम्यूनोप्रीसेंस कहा जाता है।
Abstract
आरएनए प्रतिरक्षा अग्रानुक्रम में (RIPIT) एक आरएनए:प्रोटीन (आरएनपी) परिसर के भीतर प्रोटीन की एक जोड़ी के आरएनए पैरों के निशान को समृद्ध करने के लिए एक विधि है। RIPIT दो शुद्धि कदम कार्यरत हैं. सबसे पहले, एक टैग आरएनपी सबयूनिट के इम्यूनोप्रीफिकेशन हल्के RNase पाचन और बाद में गैर-denaturing आत्मीयता elution द्वारा पीछा किया जाता है। एक और आरएनपी उपइकाई का दूसरा इम्यूनोप्रीफिशेशन एक परिभाषित परिसर के संवर्धन के लिए अनुमति देता है। आरएनए और प्रोटीन के एक denaturing elution के बाद, आरएनए पैरों के निशान उच्च थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों में परिवर्तित कर रहे हैं। आरबीपी बाइंडिंग साइटों को समृद्ध करने के लिए इम्यूनोप्रिसेप्शन (सीआईआईपी) दृष्टिकोण के बाद अधिक लोकप्रिय पराबैंगनी (यूवी) क्रॉसलिंकिंग के विपरीत, RIPIT यूवी-क्रॉसलिंकिंग स्वतंत्र है। इसलिए RIPIT आरएनए interactome में मौजूद कई प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और उससे परे आरएनए विनियमन के लिए आवश्यक हैं, लेकिन सीधे आरएनए या यूवी-क्रॉसलिंक खराब आरएनए से संपर्क नहीं करते। RIPIT में दो शुद्धि कदम बाध्यकारी साइटों की पहचान करने का एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करते हैं, जहां ब्याज का एक प्रोटीन एक और cofactor के साथ साझेदारी में कार्य करता है. डबल शुद्धि रणनीति भी पृष्ठभूमि सीमित द्वारा संकेत बढ़ाने के लिए कार्य करता है. यहाँ, हम RIPIT प्रदर्शन करने के लिए और अलग आरएनए पैरों के निशान से उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए एक कदम वार प्रक्रिया प्रदान करते हैं। हम भी RIPIT के फायदे और अनुप्रयोगों की रूपरेखा और अपनी सीमाओं में से कुछ पर चर्चा.
Introduction
कोशिकाओं के भीतर, आरएनए प्रोटीन के साथ जटिल में मौजूद है आरएनए बनाने के लिए: प्रोटीन परिसरों (RNPs). RNPs आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के आसपास इकट्ठे होते हैं (RBPs, उन है कि सीधे आरएनए बाँध) लेकिन यह भी गैर-RBPs शामिल (उन है कि आरबीपी बाँध लेकिन आरएनए नहीं), और अक्सर प्रकृति में गतिशील हैं. नियामक कार्यों को निष्पादित करने के लिए आरएनपी के भीतर आरएनपी और उनके सहकारक सामूहिक रूप से कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, निरर्थक मध्यस्थता MRNA क्षय (NMD) मार्ग में, UPF प्रोटीन (UPF1, UPF2, और UPF3b) समय से पहले समाप्त राइबोसोम को पहचानते हैं। UPF प्रोटीन के प्रत्येक आरएनए करने के लिए बाध्य कर सकते हैं, लेकिन यह केवल जब वे एक साथ इकट्ठा है कि एक सक्रिय एनएमडी परिसर के रूप में शुरू होता है. इस परिसर के भीतर, UPF1 आगे एक गैर RBP SMG1 द्वारा फॉस्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय है, और इस तरह के UPF1 सक्रियण अंततः MRNA क्षय प्रेरित कारकों की भर्ती की ओर जाताहै 1,2. इस उदाहरण में, RBPs एनएमडी चलाता है कि RNP परिसर की भर्ती और सक्रियण के लिए गैर-RBP cofactors की आवश्यकता है। अभी तक RNPs की एक और संपत्ति उनकी compositional विषमता है. spliceosome पर विचार करें, जो अलग ई, ए, बी या सी परिसरों में मौजूद है. विभिन्न स्प्लेकसम परिसरों में अतिव्यापन और विशिष्ट प्रोटीन3होते हैं . आरएनपी कार्यों का अध्ययन करने के लिए, यह स्पष्ट करना महत्वपूर्ण है कि आरएनए एक आरबीपी और इसके संबद्ध प्रोटीन से बंधे हैं। इसे पूरा करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं , प्रत्येक दृष्टिकोण के पास इसके विशिष्ट फायदे और नुकसान4,5,6,7हैं .
आरबीपी बाइंडिंग स्थलों की पहचान करने के लिए व्यापक रूप से लोकप्रिय तरीके – इम्यूनोप्रीसेप्शन (CLIP) और इसके विभिन्न रूपों के बाद क्रॉसलिंकिंग – आरएनए8के लिए एक आरबीपी को क्रॉसलिंक करने के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश पर भरोसा करते हैं। तथापि, यह आरएनपी के भीतर गैर-आरएनपी के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण नहीं है, जो सीधे आरएनए से संपर्क नहीं करते हैं। यहाँ, हम एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि एक जैसे RBPs और गैर RBPs के लिए लागू होता है का वर्णन, को अलग करने और उनके आरएनए बाध्यकारी साइटों की पहचान. इस दृष्टिकोण को आरएनए इम्यूनोप्रीसेशन को अग्रानुक्रम (आरआईआईपीटी ) कहा जाता है , जिसमें दो इम्यूनोप्रीसिप्शन चरण होते हैं , जो एकल शोधन की तुलना में उच्च विशिष्टता प्राप्त करने में मदद करते हैं (चित्र 1) 9,10. चूंकि अलग-अलग इम्यूनोप्रीफ्ट (आईपी) कदम क्लिप की तुलना में कम स्ट्रिंगमेंसी पर किए जा सकते हैं, RIPIT एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर नहीं करता है जो इम्यूनोप्रीशंस के दौरान मजबूत डिटर्जेंट की उपस्थिति का सामना कर सकता है। RIPIT का सबसे अनूठा लाभ दो शुद्धि चरणों में दो अलग प्रोटीन को लक्षित करने की क्षमता है; यह इसी तरह के अन्य परिसरों11से एक compositionally अलग आरएनपी परिसर को समृद्ध करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है.
RIPIT प्रक्रिया के लिए छोटी विविधताओं आगे RNP संवर्धन में वृद्धि कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, आरएनपी के भीतर कुछ आरएनए प्रोटीन या प्रोटीन प्रोटीन इंटरैक्शन क्षणिक होते हैं और ऐसे परिसरों के पैरों के निशान को कुशलतापूर्वक शुद्ध करना मुश्किल हो सकता है। ऐसी बातचीत को स्थिर करने के लिए, RNPs सेल lysis और RIPIT से पहले formaldehyde के साथ कोशिकाओं के भीतर crosslinked किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हमने देखा है कि एक्सॉन जंक्शन परिसर (EJC) मुख्य कारक, EIF4AIII और EJC disassembly कारक के बीच एक कमजोर बातचीत, PYM12 formaldehyde उपचार के साथ स्थिर किया जा सकता है जैसे कि अधिक आरएनए पैरों के निशान समृद्ध कर रहे हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है) सेल हार्वेस्टिंग और RIPIT से पहले, कोशिकाओं को भी एक विशेष राज्य में RNPs को स्थिर या समृद्ध करने के लिए दवाओं के साथ इलाज किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन है कि अनुवाद के दौरान MRNA से हटा रहे हैं का अध्ययन (उदाहरण के लिए, EJC13, UPF114),अनुवाद अवरोधकों के साथ उपचार जैसे puromycin, cycloheximide या harringtonकेन की वृद्धि हुई अधिभोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं आरएनए पर प्रोटीन.
RIPIT से बरामद आरएनए की मात्रा आमतौर पर कम है (0.5-10 pmoles, अर्थात्, 10-250 एनजी आरएनए 75 nt की एक औसत आरएनए लंबाई पर विचार). इस के लिए प्राथमिक कारण यह है कि केवल एक दिए गए प्रोटीन का एक छोटा सा अंश RNPs के भीतर अन्य प्रोटीन के साथ जटिल में मौजूद है (किसी भी “मुक्त” पहले कदम में IP’ed दूसरे आईपी के दौरान खो दिया है). इस आरएनए से आरएनए-सेक पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए, हम यहां पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुकूलन की रूपरेखा भी तैयार करते हैं जो ऐसे कम आरएनए आदानों के लिए उपयुक्त है15,16 (चित्र 2), जो 3 में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तैयार नमूनों की पैदावार करता है दिनों.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम RIPIT सफलतापूर्वक करने के लिए यहाँ कुछ महत्वपूर्ण विचार पर चर्चा करें। सबसे पहले, व्यक्तिगत आईपी प्रत्येक कदम पर उच्चतम संभव दक्षता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. यहाँ वर्णित कोशिकाओं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को NIH अनुदान GM120209 (जी एस) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों उनकी सेवाओं के लिए OSUCCC जीनोमिक्स साझा संसाधन कोर धन्यवाद (सीसीसी समर्थन अनुदान NCI P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
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