Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour enrichir les sites endogènes de liaison d’ARN ou « empreintes » des complexes d’ARN:protéines (RNP) des cellules mammifères. Cette approche implique deux immunoprécipitations des sous-unités de RNP et est donc surnommée immunoprécipitation d’ARN en tandem (RIPiT).
Abstract
L’immunoprécipitation d’ARN en tandem (RIPiT) est une méthode pour enrichir des empreintes d’ARN d’une paire de protéines dans un complexe d’ARN:protéine (RNP). RIPiT emploie deux étapes de purification. Tout d’abord, l’immunoprécipitation d’une sous-unité marquée de RNP est suivie de la digestion douce de RNase et de l’élution d’affinité non dénaturante suivante. Une deuxième immunoprécipitation d’une autre sous-unité RNP permet l’enrichissement d’un complexe défini. À la suite d’une suppression dénaturante des ARN et des protéines, les empreintes d’ARN sont converties en bibliothèques de séquençage de l’ADN à haut débit. Contrairement à l’ultraviolet plus populaire (UV) crosslinking suivie par l’immunoprécipitation (CLIP) approche pour enrichir les sites de liaison RBP, RIPiT est UV-crosslinking indépendant. Par conséquent RIPiT peut être appliqué à de nombreuses protéines présentes dans l’interagiome ARN et au-delà qui sont essentiels à la régulation de l’ARN, mais ne pas entrer directement en contact avec l’ARN ou UV-crosslink mal à l’ARN. Les deux étapes de purification du RIPiT offrent un avantage supplémentaire d’identifier les sites de liaison où une protéine d’intérêt agit en partenariat avec un autre cofactor. La stratégie de double purification sert également à améliorer le signal en limitant le fond. Ici, nous fournissons une procédure progressive pour effectuer RIPiT et pour générer des bibliothèques de séquençage à haut débit à partir d’empreintes d’ARN isolées. Nous exposons également les avantages et les applications du RIPiT et discutons de certaines de ses limites.
Introduction
Dans les cellules, l’ARN existe dans le complexe avec des protéines pour former des complexes ARN:protéines (RNP). Les RRP sont assemblés autour de protéines liant l’ARN (RBPs, celles qui lient directement l’ARN) mais comprennent également des non-RRP (ceux qui lient les RRP mais pas l’ARN), et sont souvent de nature dynamique. Les RRP et leurs cofacteurs fonctionnent collectivement au sein des RNi pour exécuter des fonctions réglementaires. Par exemple, dans la voie de désintégration de l’ARNm médiée par l’absurdité (NMD), les protéines UPF (UPF1, UPF2 et UPF3b) reconnaissent le ribosome prématurément terminé. Chacune des protéines de l’UPF peut se lier à l’ARN, mais ce n’est que lorsqu’elles s’assemblent ensemble qu’un complexe actif de NMD commence à se former. Dans ce complexe, UPF1 est encore activé par la phosphorylation par un SMG1 non-RBP, et une telle activation UPF1 conduit finalement au recrutement de la désintégration de l’ARNm induisant des facteurs1,2. Dans cet exemple, les RRP exigent des cofacteurs non-RBP pour le recrutement et l’activation du complexe RNP qui déclenche la MNM. Une autre propriété des RNP est leur hétérogénéité compositionnelle. Considérez le spliceosome, qui existe dans les complexes E, A, B ou C distincts. Différents complexes épiscédsome ont des protéines qui se chevauchent et des protéines distinctes3. Pour étudier les fonctions RNP, il est important d’élucider quels ARN sont liés par un RBP et ses protéines associées. De nombreuses méthodes existent pour y parvenir, chaque approche ayant ses avantages et inconvénients distincts4,5,6,7.
Les méthodes très populaires pour identifier les sites de liaison RBP — liaisons croisées suivies par l’immunoprécipitation (CLIP) et ses diverses variations – s’appuient sur la lumière ultraviolette (UV) pour relier un RBP à l’ARN8. Cependant, ce n’est pas une approche efficace pour les non-RPP dans les RNP, qui ne contactent pas l’ARN directement. Ici, nous décrivons une approche alternative qui s’applique aux RRP et aux non-RPR, pour isoler et identifier leurs sites de liaison d’ARN. Cette approche appelée immunoprécipitation d’ARN en tandem (RIPiT) se compose de deux étapes d’immunoprécipitation, qui aident à atteindre une spécificité plus élevée par rapport à une seule purification (Figure 1)9,10. Comme les étapes individuelles d’immunoprécipitation (IP) peuvent être effectuées à une chaîne inférieure par rapport à CLIP, RIPiT ne dépend pas de la disponibilité d’anticorps qui peuvent résister à la présence de détergents forts pendant l’immunoprécipitation. L’avantage le plus unique de RIPiT est la capacité de cibler deux protéines différentes en deux étapes de purification; ceci fournit un moyen puissant d’enrichir un complexe RNP compositionnellement distinct d’autres complexes similaires11.
De petites variations à la procédure RIPiT peuvent encore améliorer l’enrichissement RNP. Par exemple, certaines interactions ARN-protéines ou protéines-protéines au sein des RNP sont transitoires et il peut être difficile de purifier efficacement les empreintes de ces complexes. Pour stabiliser de telles interactions, les RNR peuvent être reliés entre eux à l’intérieur des cellules avec du formaldéhyde avant la lyse cellulaire et le RIPiT. Par exemple, nous avons observé qu’une faible interaction entre le facteur de base du complexe de jonction d’exon (EJC), EIF4AIII et le facteur de désassemblage de l’EJC, PYM12 peut être stabilisée avec un traitement au formaldéhyde de telle sorte que plus d’empreintes d’ARN sont enrichies (données non montré). Avant la récolte cellulaire et le RIPiT, les cellules peuvent également être traitées avec des médicaments pour stabiliser ou enrichir les RNi dans un état particulier. Par exemple, lors de l’étude des protéines qui sont retirées de l’ARNm pendant la traduction (p. ex., l’EJC13, UPF114), le traitement avec des inhibiteurs de traduction tels que la puromycine, le cycloheximide ou la harringtonine peut entraîner une augmentation de l’occupation de protéines sur les ARN.
La quantité d’ARN récupérée dans le RIPiT est généralement faible (0,5-10 pmoles, c’est-à-d.- 10-250 ng ARN compte tenu d’une longueur moyenne d’ARN de 75 nt). La principale raison en est que seule une petite fraction d’une protéine donnée est présente en complexe avec d’autres protéines dans les RNP (toute protéine ip’ed “libre” dans la première étape est perdue au cours de la deuxième PI). Pour générer des bibliothèques RNA-Seq à partir de cet ARN, nous avons également décrit ici une adaptation du protocole précédemment publié adapté à ces faibles entrées d’ARN15,16 (Figure 2), qui donne des échantillons prêts à sequencing à haut débit dans 3 Jours.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous discutons ici de quelques considérations clés pour effectuer avec succès RIPiT. Tout d’abord, les adresses IP individuelles doivent être optimisées pour atteindre la plus grande efficacité possible à chaque étape. La quantité de perles d’agarose DE FLAG pour le nombre d’entrées de cellules décrites ici s’est avérée robuste pour un large éventail de protéines que nous avons testées. Comme seule une petite fraction des protéines partenaires est co-immunoprécipitée avec la protéine FLAG, la quantit?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH GM120209 (GS). Les auteurs remercient l’OSUCCC Genomics Shared Resources Core pour leurs services (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
Referências
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