Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder “Footprints” von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.
Abstract
RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) ist eine Methode zur Anreicherung von RNA-Footprints eines Proteinpaares innerhalb eines RNA:Protein-Komplexes (RNP). RIPiT verwendet zwei Reinigungsschritte. Zunächst folgt auf die Immunpräzipitation einer markierten RNP-Untereinheit eine milde RNase-Verdauung und die anschließende nicht-denaturing-Affinitätselution. Eine zweite Immunpräzipitation einer anderen RNP-Untereinheit ermöglicht die Anreicherung eines definierten Komplexes. Nach einer denaturierenden Elution von RNAs und Proteinen werden die RNA-Footprints in DNA-Sequenzierungsbibliotheken mit hohem Durchsatz umgewandelt. Im Gegensatz zum populäreren ultravioletten (UV) Vernetzung gefolgt von Immunpräzipitation (CLIP) Ansatz zur Anreicherung von RBP-Bindungsstellen, RIPiT ist UV-Vernetzung unabhängig. Daher kann RIPiT auf zahlreiche Proteine angewendet werden, die in der RNA-Interactome und darüber hinaus vorhanden sind und für die RNA-Regulierung unerlässlich sind, aber nicht direkt mit der RNA oder dem UV-Kreuzvernetzen schlecht mit RNA in Kontakt treten. Die beiden Reinigungsschritte in RIPiT bieten einen zusätzlichen Vorteil bei der Identifizierung von Bindungsstellen, an denen ein Protein von Interesse in Partnerschaft mit einem anderen Cofaktor agiert. Die Doppelreinigungsstrategie dient auch dazu, das Signal durch Begrenzung des Hintergrunds zu verbessern. Hier bieten wir ein schrittweises Verfahren zur Durchführung von RIPiT und zur Generierung von Sequenzierungsbibliotheken mit hohem Durchsatz aus isolierten RNA-Footprints. Wir skizzieren auch die Vorteile und Anwendungen von RIPiT und besprechen einige seiner Einschränkungen.
Introduction
Innerhalb von Zellen existiert RNA in komplexen Proteinen, um RNA:Protein-Komplexe (RNPs) zu bilden. RNPs werden um RNA-bindende Proteine (RBPs, die RNA direkt binden) zusammengesetzt, bestehen aber auch aus Nicht-RBPs (die RBPs binden, aber nicht RNA) und sind oft dynamischer Natur. RBPs und ihre Cofactors arbeiten gemeinsam innerhalb von RNPs, um regulierungsrechtliche Funktionen auszuführen. Beispielsweise erkennen die UPF-Proteine (UPF1, UPF2 und UPF3b) im unsinnvermittelten mRNA-Zerfallsweg (NMD) das vorzeitig beendete Ribosom. Jedes der UPF-Proteine kann an RNA binden, aber erst wenn sie sich zusammensetzen, beginnt sich ein aktiver NMD-Komplex zu bilden. Innerhalb dieses Komplexes wird UPF1 durch Phosphorylierung durch ein Nicht-RBP SMG1 weiter aktiviert, und eine solche UPF1-Aktivierung führt schließlich zur Rekrutierung von mRNA-Zerfallsinduzierenden Faktoren1,2. In diesem Beispiel benötigen RBPs Nicht-RBP-Cofaktoren für die Rekrutierung und Aktivierung des RNP-Komplexes, der NMD auslöst. Eine weitere Eigenschaft von RNPs ist ihre kompositorische Heterogenität. Betrachten wir den Spliceosome, der in unterschiedlichen E-, A-, B- oder C-Komplexen existiert. Verschiedene spliceosome komplexe haben überlappende und unterschiedliche Proteine3. Um RNP-Funktionen zu untersuchen, ist es wichtig zu klären, welche RNAs durch ein RBP und die zugehörigen Proteine gebunden sind. Viele Methoden existieren, um dies zu erreichen, wobei jeder Ansatz seine deutlichen Vor- und Nachteile4,5,6,7hat.
Die weit verbreiteten Methoden zur Identifizierung von RBP-Bindungsstellen – Vernetzung gefolgt von Immunpräzipitation (CLIP) und seinen verschiedenen Variationen – verlassen sich auf ultraviolettes (UV) Licht, um ein RBP mit RNA8zu vernetzen. Dies ist jedoch kein effektiver Ansatz für Nicht-RBPs innerhalb von RNPs, die die RNA nicht direkt kontaktieren. Hier beschreiben wir einen alternativen Ansatz, der für RBPs und Nicht-RBPs gleichermaßen gilt, um ihre RNA-Bindungsstellen zu isolieren und zu identifizieren. Dieser Ansatz, der als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet wird, besteht aus zwei Immunpräzipitationsschritten, die dazu beitragen, eine höhere Spezifität im Vergleich zu einer einzigen Reinigung zu erreichen (Abbildung 1)9,10. Da die einzelnen Immunpräzipitationsschritte (IP) mit einer geringeren Stringenz im Vergleich zu CLIP durchgeführt werden können, hängt RIPiT nicht von der Verfügbarkeit von Antikörpern ab, die das Vorhandensein starker Detergenzien während der Immunpräzipitation aushalten können. Der einzigartigste Vorteil von RIPiT ist die Fähigkeit, zwei verschiedene Proteine in zwei Reinigungsschritten anzuvisieren; Dies bietet eine leistungsstarke Möglichkeit, einen kompositorisch unterschiedlichen RNP-Komplex aus anderen ähnlichen Komplexen zu bereichern11.
Kleine Variationen des RIPiT-Verfahrens können die RNP-Anreicherung weiter verbessern. Zum Beispiel sind einige RNA-Protein- oder Protein-Protein-Wechselwirkungen innerhalb von RNPs vorübergehend und es kann schwierig sein, Fußabdrücke solcher Komplexe effizient zu reinigen. Um solche Wechselwirkungen zu stabilisieren, können RNPs innerhalb von Zellen mit Formaldehyd vor der Zelllyse und RIPiT vernetzt werden. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass eine schwache Wechselwirkung zwischen dem Exon-Junction-Komplex (EJC)-Kernfaktor EIF4AIII und dem EJC-Demontagefaktor PYM12 mit Formaldehyd-Behandlung stabilisiert werden kann, so dass mehr RNA-Fußabdrücke angereichert werden (Daten nicht angezeigt). Vor der Zellernte und RIPiT können Zellen auch mit Medikamenten behandelt werden, um RNPs in einem bestimmten Zustand zu stabilisieren oder anzureichern. Wenn beispielsweise Proteine untersucht werden, die während der Translation aus der mRNA entfernt werden (z. B. eJC13, UPF114), kann die Behandlung mit Translationshemmern wie Puromycin, Cycloheximid oder Harringtonin zu einer erhöhten Belegung von Proteine auf RNAs.
Die Menge der von RIPiT zurückgewonnenen RNA ist in der Regel gering (0,5-10 Pmole, d.h. 10-250 ng RNA unter Berücksichtigung einer durchschnittlichen RNA-Länge von 75 nt). Der Hauptgrund dafür ist, dass nur ein kleiner Bruchteil eines bestimmten Proteins in Komplex mit anderen Proteinen innerhalb von RNPs vorhanden ist (jedes “freie” Protein IP’ed im ersten Schritt geht während des zweiten IP verloren). Um aus dieser RNA RNA-Seq-Bibliotheken zu generieren, skizzieren wir hier auch eine Anpassung des zuvor veröffentlichten Protokolls, das für solche niedrigen RNA-Eingänge geeignet ist15,16 (Abbildung 2), was zu hochdurchsatzbereiten Proben in 3 Tage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir besprechen hier einige wichtige Überlegungen, um RIPiT erfolgreich durchzuführen. Vor allem müssen einzelne IPs optimiert werden, um bei jedem Schritt eine höchstmögliche Effizienz zu erzielen. Die Menge an FLAG-Agarose-Perlen für die hier beschriebene Eingangsanzahl von Zellen hat sich für eine Vielzahl von Proteinen, die wir getestet haben, als robust erwiesen. Da nur ein kleiner Bruchteil der Partnerproteine mit dem FLAG-Protein ko-immunpräzipiert wird, ist die Menge an Antikörpern, die für eine effizien…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss GM120209 (GS) unterstützt. Die Autoren danken dem OSUCCC Genomics Shared Resources Core für ihre Dienste (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).
Materials
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
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| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1000 units | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
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| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
Referências
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