Avaliação do estado de fertilização por rastreamento da morfologia nuclear de espermatozóides na adubação dupla de Arabidopsis

Summary

Nós demonstramos um método para determinar a fecundação bem sucedida ou falhada com base na morfologia nuclear do esperma na fertilização dobro de Arabidopsis usando um microscópio da epifluorescência.

Abstract

As plantas de florescência têm um sistema sexual original da reprodução chamado ' fertilização dobro ', em que cada um das pilhas do sperm funde precisamente com uma pilha de ovo ou uma pilha central. Assim, dois eventos de fertilização independente acontecem quase que simultaneamente. A pilha de ovo fertilizada e a pilha central tornam-se no zigoto e no endosperm, respectivamente. Portanto, o controle preciso da dupla adubação é essencial para o desenvolvimento de sementes que se seguiu. A fertilização dupla ocorre no gametófito fêmea (saco do embrião), que é profundamente escondida e coberta com os tecidos grossos do óvulo e do ovário. Esta construção do tecido do pistilo faz a observação e a análise da fertilização dobro completamente difícil e criou a situação atual em que muitas perguntas a respeito do mecanismo da fertilização dobro permanecem sem resposta. Para a avaliação funcional de um candidato potencial para o regulador da fertilização, a análise fenotípica da fertilização é importante. Para julgar a conclusão da fertilização em Arabidopsis Arabidopsis thaliana, as formas de sinais de fluorescência rotulando núcleos de espermatozóides são usadas como indicadores. Uma célula espermática que não fertilizar é indicada por um sinal de fluorescência condensado fora das gametas femininas, enquanto uma célula espermática que fertiliza com sucesso é indicada por um sinal desnaturado devido à carigamia com o núcleo feminino dos gametas. O método descrito aqui fornece uma ferramenta para determinar a fertilização bem-sucedida ou fracassada em condições in vivo.

Introduction

Plantas floridas produzem sementes através de dupla adubação, um processo que é controlado diretamente por interações entre proteínas localizadas na membrana plasmática^degameta 1,2. Os gametas masculinos da planta de florescência, um par de pilhas de esperma, desenvolvem-se no pólen. Um tubo de pólen que cresce após a polinização entrega um par de células espermáticas para gametas femininas, uma célula de ovo e uma célula central, que se desenvolvem em um saco embrionário. Depois que os gametas masculinos e femininos se encontram, as proteínas na superfície do gameta promovem o reconhecimento, o acessório, e a....

Protocol

1. polinização artificial

Nota: Antes de iniciar o processo, é necessário um par de fórceps n º 5.

1. Cresça a. Arabidopsis thaliana (Col-0) em 22 ° c um ciclo escuro de 16-h Light/8-h em uma câmara de crescimento.
   Nota: Corte e remova a primeira haste desenvolvida da flor com as tesouras para promover o desenvolvimento de botões axilar. As plantas vigorously crescentes (2-3 semanas após o corte da primeira haste; a altura da planta aproximadamente 25 cm) são apropriadas para a análise.
2. Para emascular, remover Sepal (Figura 1b), pétala (

Results

Ovules de um pistilo polinizadas com DMP9^{KD/HTR10-MRFP} foram coletados em 7-8 HAP e observados.

A maioria dos óvulos continha dois núcleos de espermatozóides desnaturados com mRFP na célula do ovo (lado micropylar) e as posições do núcleo da célula central (lado final do charazal), respectivamente (Figura 3a), indicando dupla fertilização bem-sucedida. Além disso, foram observad.......

Discussion

HTR10-mRFP rotula a cromatina paterna (isto é, visualiza núcleos de células espermáticas), e a dinâmica na fertilização dupla foi relatada⁷. Imediatamente após a liberação de um tubo de pólen, HTR10-mRFP-rotulado núcleos de esperma ainda são condensados. Entretanto, cada um dos núcleos do esperma é desdensed em cima da fusão com um núcleo fêmea fertilizado do gameta em karyogamy três a quatro horas após a fusão⁷da membrana do gameta. As células de espermatozóides não fertil.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BX51	epifluorescência	Olympus
Vidro de cobertura	Vidro Matsunami	C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6
Fita	dupla faceNichiban	NW-15S	15 mm de largura
DP72	Olympus		Degital câmera
Fórceps	Vigor		Qualquer pinça nº 5 está disponível
Câmara de crescimento	Nihonika	LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP			Arabidopsis thaliana, ecótipo Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. ( 2007)7
Agulha de injeção	Terumo	NN-2719S	27 G
Vidro deslizante	Vidro Matsunami	S9443
SZX9	Microscópio de dissecação	Olympus
U-MRFPHQ	Olympus Cubo		filtro de fluorescência (Excitação: BP535-555, Emissão: BA570-625, Espelho dicromático: DM565)
UPlanFL N 40x	Olympus		Lente objetiva (NA 1.3), imersão em óleo
UPlanSApo 20x	Lente objetiva Olympus		(NA 0.75), seca