Utvärdering av fertilisering staten genom att spåra spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning
Summary
Vi visar en metod för att bestämma framgångsrik eller misslyckad befruktning på grundval av spermier nukleär morfologi i Arabidopsis dubbel befruktning med hjälp av en epifluorescens Mikroskop.
Abstract
Blommande växter har ett unikt sexuellt reproduktionssystem som kallas “dubbel befruktning”, där var och en av spermacellerna exakt säkringar med en äggcell eller en central cell. Sålunda äger två oberoende fertiliserings händelser rum nästan samtidigt. Den befruktade äggcell och Central cell utvecklas till zygot och Endosperm, respektive. Därför är exakt kontroll av dubbel befruktning viktigt för den efterföljande utsädesutveckling. Dubbel befruktning sker i den kvinnliga gametofyten (embryo SAC), som är djupt gömd och täckt med tjocka fröämnet och äggstock vävnader. Denna pistill vävnad konstruktion gör observation och analys av dubbel befruktning ganska svårt och har skapat den nuvarande situationen där många frågor om mekanismen för dubbel befruktning förbli obesvarade. För funktionell utvärdering av en potentiell kandidat för befruktning regulator, fenotypisk analys av befruktning är viktigt. För att döma slutförandet av befruktning i Arabidopsis thaliana, formerna av fluorescens signaler märkning spermier kärnor används som indikatorer. En spermie cell som misslyckas med att befrukta indikeras av en kondenserad fluorescens signal utanför de kvinnliga könsceller, medan en spermie cell som framgångsrikt befruktas indikeras av en dekondenserad signal på grund av karyogamy med den kvinnliga könsceller kärna. Den metod som beskrivs här ger ett verktyg för att bestämma lyckad eller misslyckad befruktning under in vivo villkor.
Introduction
Blommande växter producera frön genom dubbel befruktning, en process som styrs direkt av interaktioner mellan proteiner lokaliserade på könscell plasmamembran1,2. Blommande växt manliga könsceller, ett par spermier, utvecklas i pollen. Ett pollen rör som växer efter pollinering levererar ett par spermier till kvinnliga könsceller, en äggcell och en central cell, som utvecklas i ett embryo SAC. Efter de manliga och kvinnliga könsceller möts, proteiner på könscell ytan främja erkännande, kvarstad och fusion att slutföra dubbel befruktning. I tidigare studier, den manliga könscell membranproteiner generativ cell specifik 1 (GCS1)/hapless2 (HAP2)3,4 och könscell uttryckte 2 (GEX2)5 identifierades som fertilisering regulatorer inblandade i könscell fusion och respektive bilaga. Vi identifierade nyligen en manlig könscell-specifika membranprotein, DUF679 domän membranprotein 9 (DMP9), som en befruktning regulator inblandade i könscell interaktion. Vi fann att en minskning av DMP9 uttrycket resulterar i betydande hämning av äggcell befruktning under dubbel befruktning i a. thaliana6.
Som dubbel befruktning sker i ett embryo SAC, som är inbäddad i en fröämnet som ytterligare insvept med äggstock vävnad, är det svårt att observera och analysera de stater av dubbel befruktning processer. Av denna anledning finns det fortfarande många oklara punkter som hindrar en fullständig förståelse av hela mekanismen för dubbel befruktning kontroll. Inrättandet av observationsmetoder för att spåra beteendet hos könsceller under dubbel befruktning under in vivo villkor är oumbärlig för funktionell analys av potentiella kandidater för befruktning regulatorer. Nyligen genomförda studier har gett markör linjer där könscell subcellulära strukturer är märkta med fluorescerande proteiner. I den här artikeln visar vi ett enkelt och snabbt protokoll för att observera dubbel befruktning som har inträffat i ett embryo SAC härrör från artificiellt pollinerade pistiller. Använda spermier cell Nucleus markör linje HTR10-MRFP7, gödsling tillstånd av varje kvinnlig könscell kan diskrimineras på grundval av spermier nukleär signal morfologi. Vårt protokoll med fokus på en sådan morfologisk förändring av spermiernas kärnor vid befruktning kan effektivt få en tillräcklig mängd data för statistiska bevis. En DMP9-knockdown linje med HTR10-MRFP bakgrund (DMP9KD/HTR10-MRFP) användes som manliga växter för att visa en enda befruktning mönster. Protokollet lämpar sig också för funktionell analys av andra gödsling regulatorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
HTR10-mRFP etiketter faderlig kromatin (dvs, visualiserar spermier cellkärnor), och dynamiken i dubbel befruktning har rapporterats7. Omedelbart efter utsläpp från ett pollen rör, HTR10-mRFP-märkta spermier kärnor är fortfarande kondenserad. Emellertid, var och en av spermiernas kärnor är dekondenseras vid sammanslagning med en befruktad kvinnlig könscell kärna vid karyogamy tre till fyra timmar efter könscell membran fusion7. Obefruktade spermaceller förblir k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Japan Society för främjande av vetenskap KAKENHI Grant (JP17H05832 to T. I.) och genom finansiering från den strategiska prioriterade forsknings främjande program om fytokemiska växt molekylära vetenskaper, Chiba University (Japan).
Materials
| BX51 | Olympus | Epifluorescence microscope | |
| Cover glass | Matsunami glass | C018181 | |
| DMP9KD/HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background Takahashi et al. (2018)6 |
||
| Double-sided tape | Nichiban | NW-15S | 15 mm width |
| DP72 | Olympus | Degital camera | |
| Forceps | Vigor | Any No. 5 forceps are available | |
| Growth chamber | Nihonika | LPH-411PFQDT-SP | |
| HTR10-mRFP | Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background Ingouff et al. (2007)7 |
||
| Injection needle | Terumo | NN-2719S | 27 gauge |
| Slide glass | Matsunami glass | S9443 | |
| SZX9 | Olympus | Dissecting microscope | |
| U-MRFPHQ | Olympus | Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565) | |
| UPlanFL N 40x | Olympus | Objective lens (NA 1.3), oil-immersion | |
| UPlanSApo 20x | Olympus | Objective lens (NA0.75), dry |
Referências
- Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
- Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
- von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
- Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
- Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
- Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
- Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
- Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
- Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).
