Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung
Summary
Dual DNA Lineal Assay wird entwickelt, um die mRNA-Position während der ribosomen Translokation zu bestimmen, die auf den Dissoziationskräften der gebildeten DNA-mRNA-Duplexe beruht. Mit einer Single-Nukleotid-Auflösung und der Fähigkeit, beide Enden der mRNA zu erreichen, kann es mechanistische Einblicke für ribosome translokation liefern und andere Nukleinsäureverschiebungen untersuchen.
Abstract
Die Ribosomentranslokation bezieht sich auf die ribosomale Bewegung auf der mRNA durch genau drei Nukleotide (nt), was der zentrale Schritt in der Proteinsynthese ist. Um seinen Mechanismus zu untersuchen, gibt es zwei wesentliche technische Anforderungen. Die erste ist die Single-nt-Auflösung, die die normale Translokation von Frameshifting auflösen kann, während der sich das Ribosom um andere als 3 nt bewegt. Die zweite ist die Fähigkeit, sowohl die Ein- als auch die Ausgangsseite von mRNA zu untersuchen, um das gesamtbildende Translokation zu erläutern. Wir berichten über den dualen DNA-Lineal-Assay, der auf den kritischen Dissoziationskräften von DNA-mRNA-Duplexen basiert, die durch kraftinduzierte Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS) gewonnen werden. Mit einer Kraftauflösung von 2-4 pN reicht der Dual-Lineal-Assay aus, um verschiedene Translokationsschritte zu unterscheiden. Durch die Implementierung eines langen Linkers auf den prüfenden DNAs können sie die mRNA auf der gegenüberliegenden Seite des Ribosoms erreichen, so dass die mRNA-Position für beide Seiten bestimmt werden kann. Daher ist der Dual-Lineal-Assay einzigartig geeignet, um die ribosomsome Translokation und Nukleinsäurebewegung im Allgemeinen zu untersuchen. Wir zeigen repräsentative Ergebnisse, die auf eine geschleifte mRNA-Konformation hindeuteten und die normale Translokation von Frameshifting auflösten.
Introduction
Biomolekulare Verschiebung ist ein grundlegender Parameter bei der Untersuchung des Mechanismus der zugehörigen biologischen Funktionen. Ein besonderes Beispiel ist die Ribosomtranslokation1,2, bei der sich das Ribosom normalerweise um genau drei Nukleotide (nt) auf der Boten-RNA (mRNA) bewegt, und um eine, zwei oder andere Nt-Zahlen außer drei im Falle von Frameshifting. Daher ist eine einstellige Auflösung des molekularen Linealsystems erforderlich, um die verschiedenen Schrittgrößen zu unterscheiden. Eine größere Herausforderung besteht darin, die Ribosombewegung sowohl auf der Ein- als auch auf der Ausgangsseite zu untersuchen. Mit anderen Worten, nur mit einem Dual-Lineal-System können wir zeigen, ob die mRNA glatt durch das Ribosom gefädelt ist, oder es gibt Zwischenschritte, in denen die beiden Seiten unterschiedliche Schrittgrößen haben, die zu einer geknickten oder geschleiften mRNA-Konformation im Inneren des Ribosom.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die erste Herausforderung der Lösung verschiedener Schritte auf der Austrittsseite des Ribosoms (das 3′ Ende der mRNA) zu bewältigen. Der duale Luziferase-Assay löst die verschiedenen Leserahmen auf, indem er die Verhältnisse der resultierenden verschiedenen Proteine3,4misst. Sie gilt nur für das 3′ Ende der mRNA und reicht daher nicht aus, um ein vollständiges Bild der Translokation zu liefern. Die Massenspektrometrie kann die verschiedenen Peptidfragmente als Folge der entsprechenden Codeumlagerungen analysieren5. Aber es kann nicht genau bestimmen, wie viele nt das Ribosom auf der mRNA bewegt. Der Zehendruck-Assay ist eine weitere gängige Methode, die eine Reverse-Transkriptase verwendet, die am 3′-distalen Ende grundiert ist, um die mRNA in Richtung des Ribosoms6zu transkribieren. Es gilt jedoch nicht für das 5′ Ende von mRNA, das in das Ribosom eintritt. Andere Techniken, einschließlich Einzelmolekülansätze und Fluoreszenzmethoden7, sind schwierig, eine Single-nt-Auflösung zu erreichen.
Wir haben den Dual-DNA-Lineal-Assay entwickelt, der sowohl die Ein- als auch die Ausgangsposition der freigelegten mRNA in Ribosome-mRNA-Komplexen eindeutig bestimmen kann. Die Lineal-DNAs sind DNA-Oligomere, die Duplexe einer bestimmten Anzahl von Basepairs (bp) bilden, wobei die mRNA vom Ribosom aufgedeckt wird, unabhängig davon, welches Ende der mRNA. Die bp-Zahlen zeigen dann genau die ribosomische Position auf der mRNA während der Translokation. Die bp-Nummern der Duplexe werden durch ihre kritischen Dissoziationskräfte bestimmt, die aus der kraftinduzierten Restmagnetisierungsspektroskopie (FIRMS)8gewonnen werden. Bei 2-3 pN-Kraftunsicherheit reichen die kritischen Kräfte aus, um eine Single-nt-Auflösung zu bieten. Durch die Implementierung eines Linkermoleküls auf den DNA-Linealen kann die sterisch behinderte Seite der mRNA durch das Ribosom untersucht werden. So lassen sich unterschiedliche ribosomale Verschiebungen genau auflösen. Wir haben erfolgreich eine einzigartige Schleifenkonformation von mRNA aufgedeckt, die von Antibiotika während der Translokation9eingeschlossen wurde, und verschiedene Leserahmen aufgelöst, die auf einer rutschigen mRNA-Sequenz10koexistierten. Dieser Artikel beschreibt die Details des Dual-Lineals-Assays, zu denen die Vorbereitung der Ribosom-Komplexe, die Oberflächenfunktionalisierung der Glasgeuken, die Immobilisierung der Ribosom-Komplexe und deren Hybridisierung mit magnetisch beschrifteten DNA-Linealen gehören. Moleküle, magnetische Detektion und Kraftspektrumanalyse durch FIRMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserem Doppelherrscher-Assay spielen die magnetischen Perlen zwei wesentliche Rollen. Erstens dienen sie als Kraftgeber, weil die Fliehkraft proportional zu ihrer Auftriebsmasse ist. Zweitens sind die Perlen Signalträger, die von einem Atommagnetometer erfasst werden, das derzeit der genaueste Magnetsensor ist. Durch die Kombination von mechanischer Manipulation und magnetischer Detektion ist die FIRMS-Technik in der Lage, eine große Anzahl molekularer Wechselwirkungen auf der Grundlage ihrer kritischen Dissoziatio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von den US National Institutes of Health (R01GM111452, Y.W., S.X.) unterstützt. Y. W. würdigt die Unterstützung durch die Welch-Stiftung (E-1721).
Materials
| Styrene Strip | City of Industry | MS-861 | |
| Glass slides | Evaporated Coatings | 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3 | |
| Acetic acid | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | UCT specialties | 21400088 | |
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotin-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Sodium bicarbonate | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Epoxy glue | Devcon | 31345 | |
| Streptavidin | ThermoFisher | 434301 | |
| Fusidic Acid | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Neomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1458009 | |
| Viomycin Sulfate | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Hygromycin | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Magnesium acetate | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Ammonium chloride | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Pyruvate Kinase | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | ThermoFisher | 11205D | |
| mRNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468630 | 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 164845370 | 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 157468628 | 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 163472705 | 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678130 | 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678131 | 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678132 | 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ |
| DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | 138678133 | 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ |
| Centrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrifuge | Hitachi | CS150FNX | |
| Vortex mixer | VWR | VM-3000 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR530 | |
| Lock-in Amplifier | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Laser | Newport | TLB-6918-D | |
| Function generator | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Photo detectors | Thorlabs | DET36A |
Referências
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