Spredning er en kritisk del af cellulær funktion, og en fælles udlæser bruges til at vurdere potentielle toksicitet af nye lægemidler. Måling af spredning er derfor en hyppigt anvendt analyse i cellebiologi. Her præsenterer vi en enkel, alsidig metode til måling af spredning, der kan anvendes i vedlige og ikke-vedlige celler.
Evnen af en celle til at formere sig er en integrerende del af den normale funktion af de fleste celler, og dysregulering af spredning er kernen i mange sygdomsprocesser. Af disse grunde er måling af spredning et fælles værktøj, der anvendes til at vurdere celle funktionen. Celle proliferation kan måles ved blot at tælle; Dette er imidlertid et indirekte middel til at måle spredning. Et almindeligt middel til direkte påvisning af celler, der forbereder sig på at opdele, er ved inkorporering af mærkede nukleosid-analoner. Disse omfatter den radioaktive nukleosid analog 3H-thymidin plus ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ‘ og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU). Inkorporering af EdU opdages ved at klikke kemi, som har flere fordele i forhold til BrdU. I denne betænkning fremlægger vi en protokol til måling af spredning ved inkorporering af EdU. Denne protokol indeholder muligheder for forskellige udlæsninger, sammen med fordele og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder, hvor protokollen kan optimeres eller ændres for at imødekomme de specifikke behov i det planlagte eksperiment. Endelig, vi rører på de måder, at denne grundlæggende protokol kan ændres til måling af andre celle metabolitter.
Spredning er en kritisk del af cellulære funktion1,2. Kontrol af spredning påvirker normale processer såsom udvikling, og patologiske processer såsom kræft og hjerte-kar-sygdom. Hyperplastisk vækst af vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, menes at være en forløber for åreforkalkning3. Ændringer i celle spredning anvendes også til at vurdere potentiel toksicitet af nye lægemidler. I betragtning af dens udbredte virkning er måling af spredning en grundpille i mange cellebiologi-baserede laboratorier.
Celle spredning kan måles ved blot at tælle celler, hvis celle populationen af interesse dividerer ret hurtigt. For langsommere vækst celler kan celletal være mindre følsomt. Spredning måles ofte ved inkorporering af mærkede nukleosid analover. Selv om guldstandarden er 3H-thymidin inkorporering, mange laboratorier er at komme væk fra denne metode i betragtning af tilgængeligheden af nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse omfatter cytoplasmiske fluorescerende farvestoffer, påvisning af celle cyklus associerede proteiner, og inkorporering af ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ‘ og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU)4.
Cytoplasmiske farvestoffer, såsom carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE), detektere spredning, fordi intensiteten af farvestoffet halvdele hver gang cellen deler5. Denne teknik er almindeligt anvendt i flow cytometri for ikke-vedlige celler. Det har ikke været brugt meget for vedlige celler, men med den nye generation af billedplade læsere dette kan ændre sig. Påvisning af celle cyklus associerede proteiner gennem antistof-baserede teknikker (flow cytometri, immun histokemi, etc.) bruges ofte til væv eller ikke-vedhørende celler. Disse celler/væv skal fastgøres og permeabiliseres før farvning. Nukleosid analover BrdU og EdU er ens i tilgang til 3H-thymidin, men uden besværet med radioaktivitet. Inkorporering af BrdU påvises ved anti-BrdU antistoffer, og derfor skal cellerne fastgøres og permeabilized før farvning. Desuden skal cellerne behandles med DNase for at afsløre BrdU epitope.
Inkorporering af EdU detekteres ved at klikke kemi, hvor eller og Azid grupper “Klik” sammen i nærværelse af katalytisk kobber. Begge grupper kan fungere som det biosynthetisk indarbejdet molekyle eller detekterings molekyle4. Kommercielt tilgængelige nukleosid analoner har eller gruppen vedhæftet. For sprednings assays detekteres eller-funktionaliserede nukleosid analog ved en Azid, der er konjugeret til et fluorescerende farvestof eller en anden markør. Inkorporering af EdU har flere fordele i forhold til BrdU. For det første, fordi eller-og Azid-grupper ikke findes i pattedyrsceller, er denne interaktion meget specifik med en lav baggrund6. Da begge grupper er små, behøver cellerne ikke at gennemgå DNA-denaturering for at udsætte nukleosid-analog som krævet for BrdU7. Endelig, klik kemi er meget alsidig, og kan bruges til metabolisk mærkning af DNA, RNA, protein, fedtsyrer, og kulhydrater8,9,10,11. Hvis det metabolisk mærkede mål af interesse er på cellens overflade, kan levende celler mærkes12. Derudover kan cellerne forarbejdes yderligere til immunfluorescent farvning med antistoffer.
Følgende protokol beskriver brugen af EdU inkorporering og klik kemi at måle spredning i humane vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskellige måder inkorporering af EdU kan måles, repræsentative resultater fra hver, og deres fordele og ulemper. Måling af spredning via Klik kemi er især nyttig for klædige, langsommere voksende celler. Desuden er den morfologi af cellen velholdt og antistof-baseret farvning kan også udføres.
Inkorporering af EdU er en enkel og ligetil måde at målecelle spredning på; Det er især nyttigt for vedsiddende celler13. Vores protokol bruger glatte muskelceller, men det gælder for enhver overholder celle (epitelial, endotelal, etc.). Selv om protokollen ikke er kompliceret, det ene kritiske skridt er at gøre mærkningen løsning-ingredienserne skal tilføjes i den anførte rækkefølge. Hertil kommer, ligesom kemiluminescens Western blots, hvis du bruger luminescens udlæsning pladen ska…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Katie Carroll for teknisk assistance. Vi takker også Dr. David cool og proteomics analyselaboratorium for instruktion om og tilvejebringelse af Cytation Imaging Plate Reader. Dette arbejde blev støttet af en Wright State Foundation Grant (til L.E.W.).
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
Cytation Plate Reader | Biotek | ||
EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
Synergy Plate Reader | Biotek | ||
THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |