Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie
Summary
Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie, en een gemeenschappelijke uitlezen gebruikt om te beoordelen van de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Het meten van de proliferatie is daarom een vaak gebruikte assay in celbiologie. Hier presenteren we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van de proliferatie die kan worden gebruikt in aanhandige en niet-aanhantende cellen.
Abstract
Het vermogen van een cel om te vermenigvuldigen is een integraal onderdeel van de normale functie van de meeste cellen, en disregulatie van proliferatie is de kern van vele ziekteprocessen. Om deze redenen, het meten van de proliferatie is een gemeenschappelijk instrument gebruikt om te beoordelen van de functie van de cel. Celproliferatie kan eenvoudig worden gemeten door te tellen; Dit is echter een indirecte manier om de proliferatie te meten. Een veelgebruikte manier van het direct opsporen van cellen die zich voorbereiden op te splitsen is door toevoeging van gelabelde nucleoside analogen. Deze omvatten de radioactieve nucleoside analoge 3H-thymidine plus niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ‘ deoxyuridine (Brdu) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). De integratie van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, die verschillende voordelen heeft in vergelijking met BrdU. In dit verslag bieden we een protocol voor het meten van de proliferatie door de integratie van EdU. Dit protocol bevat opties voor verschillende uitlezingen, samen met de voor-en nadelen van elk. We bespreken ook plaatsen waar het protocol kan worden geoptimaliseerd of gewijzigd om te voldoen aan de specifieke behoeften van het geplande experiment. Ten slotte raken we aan de manieren waarop dit basisprotocol kan worden aangepast voor het meten van andere celmetabolieten.
Introduction
Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie1,2. Beheersing van proliferatie beïnvloedt normale processen zoals ontwikkeling en pathologische processen zoals kanker en hart-en vaatziekten. Hyperkunststof groei van vasculaire gladde spiercellen, bijvoorbeeld, wordt beschouwd als een voorloper van atherosclerose3. Veranderingen in celproliferatie worden ook gebruikt om de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen te beoordelen. Gezien de wijdverbreide impact, is het meten van de proliferatie een pijlers van veel op cel biologie gebaseerde laboratoria.
Celproliferatie kan worden gemeten door eenvoudigweg cellen te tellen als de celpopulatie van belang vrij snel verdeelt. Voor langzamere groeicellen kunnen celtellingen minder gevoelig zijn. Proliferatie wordt vaak gemeten door opneming van gelabelde nucleoside analogen. Hoewel de gouden standaard 3H-thymidine-integratie is, komen veel laboratoria weg van deze methode gezien de beschikbaarheid van nieuwere, niet-radioactieve alternatieven. Deze omvatten cytoplasmische fluorescerende kleurstoffen, detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten, en opname van niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ‘ deoxyuridine (BrdU) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Cytoplasmische kleurstoffen, zoals carboxyfluoresceïne DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE), detectie van proliferatie omdat de intensiteit van de kleurstof helften elke keer dat de cel verdeelt5. Deze techniek wordt vaak gebruikt in flow cytometrie voor niet-aanhandige cellen. Het is niet veel gebruikt voor aanhandige cellen, maar met de nieuwe generatie van beeldvormings plaat lezers kan dit veranderen. Detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten door middel van op antilichamen gebaseerde technieken (Flowcytometrie, immunohistochemie, enz.) wordt vaak gebruikt voor weefsels of niet-aanhangend cellen. Deze cellen/weefsels moeten voorafgaand aan de kleuring worden vast en permeabiliseerd. Nucleoside analogen BrdU en EdU zijn vergelijkbaar in benadering van 3H-thymidine, maar zonder het ongemak van radioactiviteit. De opname van BrdU wordt gedetecteerd door anti-BrdU-antilichamen en daarom moeten de cellen voorafgaand aan de kleuring worden bevestigd en permeabiliseerd. Bovendien moeten de cellen met DNase worden behandeld om de BrdU epitope bloot te leggen.
De oprichting van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, waarin alkyn en natriumazide groepen “Klik” samen in de aanwezigheid van katalytisch koper. Beide groepen kunnen dienen als het biosynthetisch opgenomen molecuul of detectie molecuul4. In de handel verkrijgbare nucleoside-analogen hebben de alkyn-groep bijgevoegd. Voor proliferatie assays, daarom, de alkyn Gefunctionaliseerde Nucleoside analoog wordt gedetecteerd door een natriumazide geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof of andere marker. De oprichting van EdU heeft verschillende voordelen ten opzichte van BrdU. Ten eerste, omdat alkyn-en natriumazide-groepen niet in zoogdiercellen worden aangetroffen, is deze interactie zeer specifiek met een lage achtergrond6. Omdat beide groepen klein zijn, hoeven cellen geen DNA denaturatie te ondergaan om de Nucleoside analoog bloot te leggen zoals vereist voor BrdU7. Tot slot, klik chemie is zeer veelzijdig, en kan worden gebruikt voor de metabole labeling van DNA, RNA, eiwitten, vetzuren, en koolhydraten8,9,10,11. Als het metabosch gelabelde doel van belang is op het celoppervlak, kunnen levende cellen worden gelabeld12. Bovendien kunnen cellen verder worden verwerkt voor immunofluorescentie kleuring met antilichamen.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van EdU-integratie en klik op chemie om proliferatie in menselijke vasculaire gladde spiercellen te meten (Figuur 1). We tonen drie verschillende manieren waarop de integratie van EdU kan worden gemeten, representatieve resultaten van elk, en hun voor-en nadelen. Het meten van proliferatie via Klik chemie is vooral handig voor aanhangend, langzamer groeiende cellen. Daarnaast is de morfologie van de cel goed onderhouden en kan ook op antilichamen gebaseerde vlekken worden uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De integratie van EdU is een eenvoudige en ongecompliceerde manier om celproliferatie te meten; het is vooral handig voor het aanhechting van cellen13. Ons protocol maakt gebruik van gladde spiercellen, maar het is van toepassing op elke aanhandige cel (epitheliale, endotheel, enz.). Hoewel het protocol niet ingewikkeld is, is het een cruciale stap om de etiketteringsoplossing te maken-de ingrediënten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd. Bovendien, zoals chemiluminescentie Western …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Katie Carroll voor technische assistentie. We danken ook Dr. David cool en het Proteomics Analyselaboratorium voor instructie over en het leveren van de Cytation Imaging Plate Reader. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Wright State Foundation (aan L.E.W.).
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referências
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. . Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
