クリック化学を用いた血管平滑筋細胞の増殖測定
Summary
増殖は細胞機能の重要な部分であり、新薬の潜在的な毒性を評価するために使用される一般的な読み出しである。したがって、増殖の測定は、細胞生物学において頻繁に使用されるアッセイである。ここでは、接着細胞および非付着細胞に使用できる増殖を測定するシンプルで汎用性の高い方法を提示します。
Abstract
細胞が増殖する能力は、ほとんどの細胞の正常な機能に不可欠であり、増殖の調節不全は多くの疾患プロセスの中心にある。これらの理由から、増殖の測定は細胞機能を評価するために使用される一般的なツールです。細胞増殖は、単にカウントすることによって測定することができます。しかし、これは増殖を測定する間接的な手段です。分裂する準備をする細胞を直接検出する一般的な手段の1つは、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによるものである。これらには、放射性ヌクレオシドアナログ3H-チミジンおよび5-ブロモ-2’デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)などの非放射性ヌクレオシド類似体が含まれる。EdUの組み込みは、BrdUと比較していくつかの利点を有するクリック化学によって検出される。本報告では、EdUの組み込みによる増殖を測定するためのプロトコルを提供する。このプロトコルには、さまざまな読み出しのオプションと、それぞれの長所と短所が含まれています。また、計画された実験の特定のニーズを満たすためにプロトコルを最適化または変更できる場所についても説明します。最後に、この基本的なプロトコルを他の細胞代謝産物を測定するために変更する方法について説明します。
Introduction
増殖は細胞機能1、2の重要な部分である。増殖の制御は、発達などの正常なプロセス、および癌および心血管疾患のような病理学的プロセスに影響を与える。血管平滑筋細胞の過形成成長は、例えば、アテローム性動脈硬化症3の前駆体であると考えられている。細胞増殖の変化は、新薬の潜在的な毒性を評価するためにも使用されます。その広範な影響を考えると、増殖の測定は多くの細胞生物学ベースの研究室の主力です。
細胞増殖は、目的の細胞集団がかなり急速に分裂する場合、単に細胞を数えることによって測定することができる。成長が遅い細胞の場合、細胞数の感度が低下する可能性があります。増殖は、多くの場合、標識されたヌクレオシド類似体の組み込みによって測定される。ゴールドスタンダードは3H-チミジンの組み込みですが、多くの研究所は、新しい非放射性代替品の入手可能性を考えると、この方法から脱却しています。これらには、細胞傷害性蛍光色素、細胞周期関連タンパク質の検出、および5-ブロモ-2’デオキシウリジン(BrdU)および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)4のような非放射性ヌクレオシド類似体の組み込みが含まれる。
カルボキシフルオレセインジアセテートコハシニジルエステル(CFSE)などの細胞質色素は、細胞が5個分裂するたびに色素の強度が半分になるため増殖を検出する。この技術は、非付着細胞のフローサイトメトリーで一般的に使用されます。接着細胞にはあまり使用されていませんが、新世代のイメージングプレートリーダーではこれが変わる可能性があります。抗体ベースの技術(フローサイトメトリー、免疫組織化学など)による細胞周期関連タンパク質の検出は、組織または非付着細胞にしばしば使用される。これらの細胞/組織は、染色前に固定し、透過する必要があります。ヌクレオシド類似体BrdUおよびEdUは、3H-チミジンへのアプローチが似ているが、放射能の不便さがない。BrdUの組み込みは抗BrdU抗体によって検出されるため、細胞は染色前に固定され、透過する必要があります。さらに、細胞はBrdUエピトープを露出させるためにDNaseで処理されなければならない。
EdUの組み込みは、アルキンとアジドが触媒銅の存在下で一緒に「クリック」をグループ化するクリックケミストリーによって検出されます。いずれの基も、生合成的に組み込まれた分子または検出分子4として機能することができる。市販のヌクレオシド類似体は、アルキン基が付着している。増殖アッセイの場合、従って、アルキン機能化ヌクレオシドアナログは、蛍光色素または他のマーカーに共役したアジドによって検出される。EdUの組み込みには、BrdUに対していくつかの利点があります。まず、アルキン基とアジド基は哺乳動物細胞に見つからないため、この相互作用は低いバックグラウンド6で非常に特異的である。両方の基が小さいので、細胞はBrdU7に必要な核酸類似体を露出させるためにDNA変性を受ける必要はない。最後に、クリックケミストリーは汎用性が高く、DNA、RNA、タンパク質、脂肪酸、および炭水化物8、9、10、11の代謝標識に使用することができる。目的とする代謝標識ターゲットが細胞表面上にある場合、生細胞は12と標識することができる。さらに、細胞は抗体による免疫蛍光染色のためにさらに処理することができる。
次のプロトコルは、ヒト血管平滑筋細胞における増殖を測定するためのEdU組み込みおよびクリック化学の使用について説明する(図1)。EdUの組み込み方法、それぞれ代表的な結果、長所と短所の3つの異なる方法を示します。クリックケミストリーによる増殖の測定は、付着性、成長の遅い細胞に特に有用である。また、細胞の形態は良好に維持され、抗体ベースの染色も行うことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
EdUの組み込みは、細胞増殖を測定するための簡単で簡単な方法です。これは、接着細胞13に特に有用である。当社のプロトコルは平滑筋細胞を使用しますが、任意の付着細胞(上皮、内皮など)に適用可能です。プロトコルは複雑ではありませんが、1つの重要なステップはラベリングソリューションを作ることであり、成分はリストされている順序で追加する必要があります?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ケイティ・キャロルの技術支援に感謝します。また、ドクター・デビッド・クールとプロテオミクス解析研究所のサイエンスイメージングプレートリーダーの指導と提供に感謝します。この作品はライト州財団の助成金(L.E.W.へ)によって支えられた。
Materials
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referências
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