I denne artikkelen presenterer vi og diskutere nye utbygginger i syntese og anvendelser av nukleinsyre acid Microarrays fabrikkert in situ. Nærmere bestemt viser vi hvordan protokollene for DNA-syntese kan utvides til RNA og hvordan Microarrays kan brukes til å lage hentes nukleinsyre yre biblioteker.
Foto litografi er en kraftig teknikk for syntese av DNA-oligonukleotider på glass sklier, da den kombinerer effektiviteten til phosphoramidite koplings reaksjoner med presisjonen og tettheten av UV-lys som reflekteres fra mikrometer speil. Foto litografi gir Microarrays som kan romme fra hundretusener opp til flere millioner forskjellige DNA-sekvenser, 100-NT eller lengre, på bare noen få timer. Med denne svært store sekvensen plass, Microarrays er ideelle plattformer for å utforske mekanismer for nukleinsyre acid · ligand interaksjoner, som er spesielt relevant i tilfelle av RNA. Vi har nylig rapportert om utarbeidelse av et nytt sett med RNA-phosphoramidites som er kompatible med in situ Foto litografi og som senere ble brukt til å dyrke RNA-oligonukleotider, homopolymers samt blandede base sekvenser. Her illustrerer vi i detalj prosessen med RNA Microarray fabrikasjon, fra eksperimentell design, til instrumental oppsett, array syntese, deprotection og endelig hybridisering analysen ved hjelp av en mal 25mer sekvens som inneholder alle fire baser som et eksempel. Parallelt går vi utover hybridisering eksperimenter og utnytter Microarray Foto litografi som en billig gateway til komplekse nukleinsyre acid biblioteker. For å gjøre dette, er høy tetthet DNA Microarrays fabrikkert på en base-sensitive monomer som gjør at DNA å være beleilig kløyvde og hentes etter syntese og deprotection. Den fabrikasjon protokollen er optimalisert for å begrense antall syntetiske feil og at effekten, et lag av β-karoten løsning er innført for å absorbere UV fotoner som kan ellers reflektere tilbake på syntese underlag. Vi beskriver i en trinnvis måte den komplette prosessen med biblioteks forberedelser, fra design til kløft og kvantifisering.
Den praktiske bruken av DNA-Microarrays har tradisjonelt vært i studiet av variasjonene i gen uttrykks nivåene mellom to celle populasjoner, ved hjelp av komplementære tråder og fluorescens som deteksjons metode1. Av og til DNA Microarrays venture i bindende hendelser med ikke-nukleinsyre acid ligander, slik som proteiner, med en strategi for systematisk sekvens permutasjon som gir en omfattende oversikt over bindings landskapet2,3, 4,5. Denne tilnærmingen forvandler effektivt Microarrays fra bare hybridisering overflater til plattformer med bred sekvensdekning, noe som ville være et aktivum for studiet av den rikere og mer komplekse verden av RNA struktur og funksjon. Støttet av ekstremt effektiv phosphoramidite kopling reaksjon6, in SITU syntetisert DNA arrays kan nå også betraktes som en billig kilde til DNA7, som blir spesielt relevant med tanke på stadig økende etterspørsel etter nukleinsyre yre materiale for gen montering8,9, DNA-basert nanostrukturer10, informasjonslagring eller sekvensering11,12. På samme måte vil sekvensering teknologier trolig dra nytte av utviklingen av metoder som gir svært komplekse blandinger av RNA oligonukleotider13. I denne konteksten, array fabrikasjon protokoller som gjør det mulig for oligonukleotider å bli syntetisert in situ og ved høy tetthet er ideelt plassert for å møte behovene til den raskt voksende feltet av nukleinsyre acid bioteknologi. Men med et felt så forskjellige som bioteknologi, kan formålet med hvert program kreve at DNA på Microarray produseres enten ved høy gjennomstrømming eller med en svært lav mengde syntetiske feil14,15, eller begge, som krever en nærmere titt på syntese protokoller av DNA Microarrays som historisk har vært primært optimalisert for hybridisering analyser. I mellomtiden, in situ syntese av RNA Microarrays har blitt funnet å være en utfordrende forsøke, med de fleste av vanskelighetene forbundet med å beskytte gruppen for 2 ‘-OH funksjon, vanligvis en silyl moiety i standard solid-fase syntese som er fjernet med fluor reagenser, kjemikalier som ikke er kompatible med glass eller silisium overflater. De spørsmål og utfordringer i DNA og RNA Microarray syntese har i det siste vært gjenstand for en stor kropp av arbeid, særlig med foto litografi tilnærming16.
Foto litografi bruker UV-lys for å oppheve oligonukleotider før kopling og krever masker for å konstruere et mønster av UV-eksponering, og dermed romlig organisering og kontrollere veksten av oligonukleotider. Fysiske masker har blitt erstattet av datastyrte micromirrors hvis vippe selektivt reflekterer UV lys på Microarray underlaget17,18,19. Som en UV-kilde, bruker vi 365 NM lys fra en høyeffekts LED-kilde20. Nåværende photolithographic oppsett er utstyrt med Micromirror Device arrays inneholder 1024 × 768 speil, tilsvarende mer enn 780 000 individuelt adresserbart flekker (“funksjoner”) på et lite område på bare 1,4 cm2, eller 1080p med matriser av 1920 × 1080, eller > 2 millioner speil. Hver av speilene i enheten har derfor direkte kontroll over sekvensen vokst på tilsvarende funksjon. Med unntak av UV-lys, foto litografi funksjoner som en solid fase syntese teknikk og vedtar syklus BAS ert phosphoramidite kjemi. Bare det krever en helt annen beskyttelses strategi for RNA-syntese for å lykkes. Vi utviklet en ny serie med lysfølsomme RNA-phosphoramidites som lager hydrazin-labilt som beskytter grupper21. Disse monomerer gjør det mulig for RNA-er å bli deprotected under milde forhold som ikke påvirker integriteten til overflaten. Et første deprotection trinn bruker triethylamine til å fjerne cyanoethyl phosphodiester beskytte grupper, mens hydrazin brukes i et sekund, separate trinn for å fjerne dem på 2 ‘-OH og exocyclic Amin funksjoner. Dermed kan RNA oligonukleotider ~ 30-NT i lengde og en hvilken som helst sekvens nå bli syntetisert in situ på Microarrays22,23. Parallelt, vi har også nylig begynt å ta opp spørsmål om gjennomstrømning, kvalitet og hastighet i DNA og RNA Foto litografi. Vi målte koblings effektiviteten > 99% for alle DNA-og RNA-amidites (figur 1) og undersøkte hvert enkelt trinn i oligonukleotid forlengelse syklus, fra oksidasjons tid, til valg av Aktivator og til optimal UV-eksponering24 , 25. we har brakt inn nye lysfølsomme 5 ‘ beskytte grupper som kan fjernes i løpet av sekunder, transformere syntesen av hundretusenvis av 100mers i et par timer lang prosess26. Vi har også doblet gjennomstrømningen av array fabrikasjon ved å utsette to underlag samtidig27. Til slutt har vi innført en dT phosphoramidite som inneholder en base-sensitiv succinyl gruppe som en praktisk måte å holde, samle og analysere DNA og RNA oligonukleotider, som er sentralt i biblioteks forberedelser28.
Til tross for den relativt kjedelige aspektet av DNA og RNA solid-fase syntese, spesielt for nukleinsyre yre kjemikere, Microarray Foto litografi fortsatt en ikke-triviell oppgradering krever et komplekst oppsett, nøye kontroll og tilsyn med prosessen, og separate instruksjoner for post-syntetisk håndtering avhengig av arten av oligonukleotid og type søknad. I denne artikkelen ønsker vi å gi en detaljert presentasjon av hele steg-for-steg prosedyre av in situ syntese av DNA og RNA Microarrays av foto litografi, fra eksperimentell design til dataanalyse, med vekt på utarbeidelse av instrumenter og forbruksvarer. Deretter beskriver vi de post-syntetiske deprotection metodene som samsvarer med det tiltenkte formålet med Microarray fabrikasjon (dvs. enten hybridisering eller utvinning av nukleinsyre syre biblioteker).
Solid-fase DNA og RNA syntese er brødet og smør av hver nukleinsyre acid kjemi lab, og selv om tillegg av foto litografi komponenten er riktignok en kompleks operasjon, Microarray fabrikasjon formidlet av UV-lys er også en svært pålitelig prosess . Det er i tillegg den eneste tilgjengelige metoden for in situ RNA syntese på Microarrays. Likevel, som i alle multi-Stage eksperimentell prosedyre, det er god plass for menneskelig feil.
Kanskje den mest kritiske trinnet er koblingen av en phosphoramidite, som det er behov for å være en stadig høy gir kjemisk reaksjon for å ha råd til oligonukleotider med få syntetiske feil. I vår Microarray syntese protokollen, er phosphoramidite kopling enda mer sentral til generell syntese kvalitet siden fabrikasjon prosessen omgår capping og forhindrer oligonukleotid rensing. Trinnvis koblings effektivitet over 99% er beregnet for alle fotosensitive DNA-og RNA-phosphoramidites, selv for svært korte koblingstider (15 s)24 , men lavere koblings kapasitet kan av og til forekomme, spesielt i tilfelle av dG-amidites. Stabiliteten av solubilized phosphoramidites ved romtemperatur har blitt undersøkt før og ble vist å avhenge av arten av nucleobase, med guanosin phosphoramidites utsatt for omfattende degradering i bare et spørsmål om dager29, 30i det. Men da det ble oppbevart ved-25 ° c, ble dG phosphoramidites oppløst i ACN som 30 mM løsning for å være stabile i flere uker. Den relative ustabilitet i dG phosphoramidite løsninger ved romtemperatur betyr imidlertid at de ikke skal holdes festet til DNA-synthesizer i flere dager.
For RNA-phosphoramidites er koplings utbyttet svært avhengig av phosphoramidite kvalitet (som kan vurderes med 31P NMR spektroskopi) og koblingstid. Koblingstider på 5 minutter for rA, rG, rC og 2 min for rU synes nødvendig. Faktisk fant vi ut at forkorte kondens tiden til 2 min for alle RNA phosphoramidites førte til betydelig lavere hybridisering signaler.
Selve DNA-synthesizer, samt reagenser og løsemidler, må absolutt være så rene som mulig for å oppnå høyest utbytte av oligonukleotid syntese. Imidlertid kan uløselig materiale, salter eller partikler, akkumuleres over tid i linjene og slangen i leveringssystemet, noe som fører til en gradvis reduksjon i forbruket av reagenser og reaktantene. Der en generell rengjøring av synthesizer ikke løser et lavt utgangs volum, kan en økning i antall pulser være en alternativ løsning. Spesielt nyttig i tilfelle av lavt phosphoramidite forbruk, kan linjen i koplings protokollen som tilsvarer pumping av en blanding av phosphoramidite og aktivator (tredje linje av koplingen ledd i tabell 1 og tabell 2) være modifisert, fra 6 til 9 pulser uten merkbar negativ effekt på syntese kvalitet. Videre, antall pulser av aktivator som trengs for å bringe amidite/aktivator Mix til syntese substrat (for tiden 6, fjerde linje i koblingen ledd, se tabell 1 og tabell 2) avhenger av DNA synthesizer seg selv så vel som på slange lengden i syntese cellen. Dette tallet kan justeres etter utskifting av phosphoramidite med en farget oppløsning og telling av antall pulser som trengs for å presse den fargede blandingen til glass underlaget for kopling.
Metoden som beskrives her, gjør det mulig for DNA-og RNA-syntese å fortsette samtidig, på samme Microarray. Hybrider av DNA og RNA kan også være forberedt uten noen endring i array fabrikasjon protokoller, og så lenge de tre-trinns deprotection protokollen er fulgt. Det bør imidlertid bemerkes at RNA-bare Microarrays bare krever en to-trinns deprotection: en decyanoethylation først med et3N etterfulgt av hydroksyl og base deprotection med hydrazin. DNA-nucleobases ble funnet å være ufullstendig deprotected under disse forholdene, og trenger ytterligere trinn i EDA for å kunne gjennomføre fullstendig fjerning av phenoxyacetyl (PAC) grupper. Denne ekstra behandlingen med EDA er kortere (5 min) enn for standard deprotection av DNA-Microarrays31, men det er tilstrekkelig å kjøre den til ferdigstillelse etter triethylamine og hydrazin behandlinger. I tillegg begrenser en kort reaksjonstid med EDA eksponeringen av en fullt deprotected RNA-oligonukleotid til grunnleggende forhold.
En fordel med in situ RNA array syntese over alternative metoder som spotting eller DNA transkripsjon32,33,er34 muligheten til å lagre syntetisert RNA microchip i beskyttet form til bruk, og dermed unngå risikoen for potensiell RNA-degradering. Etter syntetiske prosedyrer for RNA betyr derimot at forbruksvarer og reagenser holdes sterile og at håndteringen utføres under RNase-frie forhold. Av notatet, fant vi at tillegg av RNase hemmer til hybridisering Mix ikke gi sterkere hybridisering signaler for RNA funksjoner.
Syntesen av DNA-bibliotekene på en base-følsom monomer er mer kompleks enn syntesen av noen kontroll sekvenser på en overflate, og som sådan er sikkert mer utsatt for design feil. Likevel, forutsatt at sekvensen design (dvs. naturen og antall sekvenser) er riktig, transformere denne listen til en samling av eksponering masker og en organisert serie av kopling sykluser forblir en grei prosess. Imidlertid, betydelig variasjoner fra målestokk Microarray syntese eksisterer og er betenkelig å en heldig fabrikasjon av en høy-tettheten bibliotek oppstille.
Først er en base-følsom dT monomer kombinert som den første phosphoramidite etter syntese av linker. Koblings utbyttet fra denne monomer (figur 1) ble funnet å være relativt lav, rundt 85%28, noe som er grunnen til at arbeidet er gjort for å forbedre sin innlemmelse rate, enten ved å øke konsentrasjonen i ACN fra 30 mm til 50 mm, eller ved å gjenta koplings trinn: to påfølgende koblings reaksjoner ved hjelp av ferske monomerer, eller to separate, men påfølgende koplings sykluser.
Den andre endringen er tilsetning av en β-karoten løsning i bakre kammer av syntese cellen, som beleilig absorberer 365 NM lys. Dette er en viktig modifikasjon av foto litografi oppsett som hindrer UV-lys fra å reflektere tilbake på array underlaget. Faktisk, etter traversering mellomliggende medium mellom underlag, innkommende UV-lys utganger gjennom boret lysbildet og når kvarts blokk av cellen. Den Fresnel ligninger spår at ~ 4% av vinkelrett hendelsen UV-lys vil reflektere fra hver av de tre nedstrøms luft-glass grensesnitt (Exit side av 2nd substrat og begge sider av kvarts blokk) og tilbake på syntese substrat, fører til utilsiktet eksponering av photoprotected oligonukleotider. Diffraksjon og spredning bidrar også til “off-target” photodeprotection og derfor til nukleotid innsetting, som direkte påvirker feilfrekvensen av syntese, men disse bidragene er mye mindre enn refleksjoner og kan i hovedsak bli behandlet av redusere syntese tetthet (forlater gap mellom funksjoner). Vi har funnet at nivået av β-karoten løsning i nedre kammeret av cellen har en tendens til å minske litt bare i løpet av de første minuttene av array syntese, og derfor må overvåkes og justeres.
Til slutt, den tredje endringen er deprotection løsning, erstatter EtOH for toluen, som holder kløyvde DNA biblioteket bundet til overflaten, antagelig gjennom elektrostatisk samhandling. Ved å bruke en liten mengde vann til syntese området etter ACN-vasking, kan biblioteket enkelt samles inn. Prosessen er imidlertid bare vellykket hvis vanninnholdet i EDA og toluen er minimalt, og gjengir nukleinsyre syre helt uløselig i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-bibliotekene være kløyvde av chip ved hjelp av ammoniakk9,10,14,35, deretter ytterligere deprotected ved å varme opp DNA-inneholdende vandig ammoniakk løsning til 55 ° c over natten. Gjenvinning av DNA-bibliotekene ved hjelp av ammoniakk er imidlertid ikke kompatibel med RNA. RNA-oligonukleotider på et base-spaltbare substrat kan eluert fra overflaten ved hjelp av samme EDA/toluen-prosedyre som beskrevet ovenfor, men bare ved den nest siste etappen etter et3N og hydrazin to-trinns deprotection strategi28.
Alternative strategier for å gjenopprette oligonukleotid bassenger fra Microarrays uten behov for en bestemt grunnleggende behandling finnes, er i prinsippet kompatibel med foto litografi og stole på bruk av enzymer. For eksempel kan en enkelt deoxyuracil nukleotid være målet for uracil-DNA-glycosylase (UDG) og excised fra resten av DNA-sekvensen, eller en enkelt RNA-enhet kan gjenkjennes av RNase H type 2-enzymer og phosphodiester Bond 5 ‘ til RNA-kløyvde , slippe 5 ‘ DNA del23.
Vi har nå en kraftig, pålitelig og høy tetthet metode for syntese av DNA, RNA, og hybrid DNA/RNA Microarrays. Disse kan ikke bare tjene som plattformer for hybridisering eller bindende analyser36, men de representerer også en rask og rimelig måte å produsere komplekse nukleinsyre acid biblioteker. For DNA-basert digital datalagring, kan Microarray Foto litografi bli en potensiell løsning på “skrive” flaskehalsen (dvs. til koding av informasjon ved syntese). Suksessen i Digital koding på DNA og i de Novo Gene forsamlingen avhenger sekvens troskap som, på syntese nivå, oversettes til feil rate. Syntetiske og optiske feil i våre nåværende array fabrikasjon protokoller vil bli diskutert og rapportert på andre steder. Parallelt er arbeidet nå i gang for ytterligere å øke fabrikasjon skala og gjennomstrømning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den østerrikske Science Fund (FWF tilskudd P23797, P27275 og P30596) og Swiss National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).
Slide functionalization | |||
Acetic acid >99.8% | Sigma | 33209 | For RNA deprotection |
CNC router | Stepcraft | 300 CK | |
Ethanol absolute | VWR | 1.07017.2511 | For deprotection and functionalization |
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide | Gelest | SIT8189.5 | Silanizing reagent |
Nexterion Glass D microscope slides | Schott | 1095568 | |
Polymax 1040 | Heidolph | Orbital shaker | |
Proclean 507 Ultrasonic water bath | Ulsonix | To clean slides after drilling | |
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner | Sigma | Z860086 | To clean slides after drilling |
Microarray synthesis | |||
0.25 M dicyanoimidazole in ACN | Biosolve | 0004712402BS | Activator |
0.7 XGA DMD | Texas Instruments | Digital Micromirror Device | |
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF | Sigma | L860020-06 | Oxidizer |
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer | FFKM | Lower teflon gasket | |
2'-O-ALE RNA phosphoramidites | ChemGenes | ||
365 nm high-power UV-LED | Nichia | NVSU333A | |
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites | Orgentis | ||
5'NPPOC DNA phosphoramidites | FlexGen | ||
Acetonitrile | Biosolve | 0001205402BS | For DNA synthesis |
Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma | L010010 | For dissolving phosphoramidites |
Cleavable dT | ChemGenes | Base-sensitive monomer for library preparation | |
DMSO | Biosolve | 0004474701BS | As exposure solvent |
DNA and RNA microarray deprotection | |||
Ethylenediamine >99.5% | Sigma | 3550 | For deprotection |
Expedite 8909 | PerSeptive Biosystems | DNA synthesizer | |
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine | Sigma | 225819 | For RNA deprotection |
Imidazole | Sigma | 56750 | |
Industrial Strength lower-density PTFE tape | Gasoila | Thin, upper teflon gasket | |
Pyridine >99% | Sigma | P57506 | For RNA deprotection |
Triethylamine >99% | Sigma | T0886 | For RNA deprotection |
β-carotene | Sigma | C9750 | For library preparation |
Hybridization and scanning | |||
20x Sodium Saline Citrate | Roth | 1054.1 | |
5'Cy3-labelled complementary strand | Eurogentec | For duplex hybridization | |
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube | Eppendorf | ||
BSA (10 mg/mL) | Promega | R3961 | |
EDTA molecular biology grade | Promega | H5031 | |
GenePix 4100A | Molecular Devices | Microarray scanner | |
Hybridization oven | Boekel Scientific | 230500 | |
MES monohydrate | Sigma | 69889 | |
MES sodium | Sigma | M3058 | |
NaCl >99.5% | Sigma | 71376 | |
SecureSeal SA200 hybridization chamber | Grace BioLabs | 623503 | |
Spectrafuge mini | Labnet | C1301 | Microarray centrifuge |
Tween-20 molecular biology grade | Sigma | P9416 | |
Data extraction | |||
Excel | Microsoft | For data extraction | |
MatLab | MathWorks | Microarray design | |
NimbleScan 2.1 | Roche NimbleGen | ||
Desalting and quantification | |||
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Toluene | Merck | ||
ZipTip C18 | Millipore | ZTC18s008 | Desalting pipet tips |