جيل من الكبد البشرية العظام الإنسان الجلد البقري النظام الأساسي في الفئران نقص المناعة
Summary
تم إنشاء نماذج الماوس الخاصة بالعظام البشرية المنتشرة في الكبد باستخدام تقنيات غرس العظام الجراحية مع قطعه الورم المشتقة من المريض وتقنيات حقن الابر مع الخلايا البشرية المستزرعة من سرطان الجلد البقري.
Abstract
في العقود الاخيره ، تم الاعتراف بشكل متزايد بالأورام الجلدة المزروعة بالمرض المشتقة من المريض أو خطوط الخلايا البشرية المثقفة كنماذج أكثر تمثيلا لدراسة السرطانات البشرية في الفئران ضعيفه المناعة من الخلية البشرية التقليدية خطوط في المختبر. في الاونه الاخيره ، تم تطوير نماذج الأورام التي تم زرعها بالمريض والمستخرجة من المخ (PDX) في الفئران لتحسين تكرار ميزات أورام المريض. ومن المتوقع ان يكون نموذج الماوس الكبدية العظام المجسمة منصة أبحاث السرطان مفيده, توفير رؤى في علم الاحياء الورم والعلاج بالعقاقير. ومع ذلك ، فان زرع ورم الكبد التقويمي معقد بشكل عام. هنا نقوم بوصف البروتوكولات الخاصة بنا لغرس العظام المستخلصة من أورام الميلانوما المستمدة من المريض الكبدي المنتشر في الكبد. لقد قمنا باستزراع الكبد البشري المنتشر في الفئران الخلوية يمكن ان ينتج عن البروتوكولات معدلات نجاح تقنيه عاليه باستمرار باستخدام تقنيه غرس العظام الجراحية مع قطع من ورم الميلانوما المشتق من المريض أو تقنيه حقن ابره مع خط الخلايا البشرية مثقف. كما نقوم بوصف البروتوكولات الخاصة بالمسح المقطعي للكشف عن أورام الكبد الداخلية وتقنيات أعاده الغرس باستخدام الأورام بالتبريد لتحقيق أعاده التطعيم. معا ، توفر هذه البروتوكولات منصة أفضل لنماذج الفئران الورم الأورام الكبدية من الميلانوما الكبد المنتشرة في البحوث الانتقالية.
Introduction
الميلانوما هو الورم الخبيث داخل العين الأكثر شيوعا بين البالغين في العالم الغربي. وخلال السنوات 50 الماضية ، ظلت حالات الاصابه بسرطان الجلد البقري (5.1 حاله في المليون) مستقره في الولايات المتحدة1و2. ينشا سرطان الجلد الميلاني من الخلايا الصباغية في القزحية ، الجسم الهسلاري ، أو المشيميه ، وهو مرض مميت للغاية عندما يتطور الانبثاث. وكان معدل الوفاات من المرضي الذين يعانون من سرطان الجلد الميلاني الورم الخبيث 80 ٪ في 1 سنه و 92 ٪ في 2 سنوات بعد التشخيص الاولي للنقائل. الوقت بين تشخيص الانبثاث والموت عاده ما تكون قصيرة ، اقل من 6 أشهر ، دون التحية للعلاج3،4. ينتشر السرطان من خلال الدم ويميل إلى الانتشار بشكل مهيمن إلى الكبد (89-93%)4,5. وهناك حاجه ماسه إلى نموذج الماوس فعاله لمزيد من التحقيق في سرطان الجلد الكبد المنتشرة الورم الميلاني. للبحوث الانتقالية ، هناك طلب واضح لتوليد الكبد المترجمة المنتشرة نموذج الماوس الميلانوما.
ومن المتوقع ان توفر نماذج الفئران التي تستمد من المريض الأورام الخبيثة (PDX) استراتيجيات الطب الفردية. وقد تكون هذه النماذج التنبؤيه للنتائج السريرية ، وتكون مفيده لتقييم المخدرات قبل السريرية ، وتستخدم للدراسات البيولوجية للأورام6. نماذج PDX التمثيلية هي الفئران المزروعة بالأورام الخبيثة ، والتي لديها ورم في المواقع تحت الجلد. يمكن لمعظم الباحثين القيام بعمليه جراحيه لزرع تحت الجلد دون ممارسه خاصه7,8. كما يمكنهم أيضا مراقبه الأورام تحت الجلد بسهوله. علي الرغم من ان نماذج PDX تحت الجلد أصبحت شعبيه في مرحله البحث ، لديهم بعض العقبات في الانتقال إلى الاستخدام العملي. الزرع تحت الجلد قوات المرضي المستمدة من الأورام لكسب الطعم في بيئة مجهريه مختلفه من أصل الورم ، بحيث يؤدي إلى فشل الاستخلاص وبطء نمو الورم 9،10،11، 12و13و14. قد يكون المنهج التقويمي أكثر مثاليه وعقلانيه لنموذج pdx لأنه يستخدم نفس الجهاز مثل الورم الأصلي15,16.
في الاونه الاخيره ، قمنا بتطوير بروتوكولات لتقنيات زرع العظام الجراحية لأورام سرطان الجلد التي تستمد من المريض الكبد والمنتشرة وتقنيات حقن الابر مع الكبد البشري المنتشرة-خط خلايا سرطان الجلد الميلاني في إيماءه. Cg-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (موردي المجموعة) الفئران17،18. وتؤدي البروتوكولات إلى معدلات نجاح تقنيه عاليه باستمرار. كما انشانا تقنيات المسح المقطعي التي هي مفيده للكشف عن أورام الكبد الداخلية ، وطورنا أعاده غرس الأورام بالتبريد في منصة PDX. وجدنا ان الأورام الميلانوما الورم الميلانيني النماذج الحفاظ علي خصائص الورم الكبد المريض الأصلي ، بما في ذلك السمات الخلوية والجزيئية. معا ، توفر هذه التقنيات منصة أفضل لنماذج الأورام السرطانية الكبدية لسرطان الجلد البقري في البحث الانتقالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونماذج الكسب غير المكثف الحالية التي تتطلب عملا كثيفا ، وتستغرق وقتا طويلا ، وباهظه التكلفة لإنشاءها. وقد أنشئت نماذج الماوس الورم المجسم الأورام الخبيثة لسرطان الكبد أكثر من عقدين من الزمان19،20،21. ومع ذلك ، هذه التقنية معقده وتتطلب استخ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر السيد اوهارا ، والسيد ك. سايتو ، والسيد تيراي ، علي استعراض المخطوطة. ويقر المؤلفون بالمراجعة النقدية للمساعدة التحريرية والانجليزيه لهذه المخطوطة من قبل الدكتور ر. ساتو في مركز فوكس تشيس للسرطان. تم دعم العمل الموصوف هنا من قبل صندوق البحوث بوني كرول ، وصندوق البحوث مارك وينزيرل ، وصندوق بحوث سرطان الجلد العين في جامعه توماس جيفرسون ، ومؤسسه المجتمع اوساكا ، و JSPS KAKENHI منحه رقم JP 18K15596 في مدينه اوساكا جامعه. وكانت الدراسات في مختبر الدكتور ا. أبلين مدعومة بمنحه المعاهد القومية للصحة R01 GM067893. وقد تم تمويل هذا المشروع أيضا من قبل جائزه عميد العلوم التحويلية ، وهي جائزه المبادرة البرنامجية لجامعه توماس جيفرسون.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Referências
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Pesquisa do Câncer. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Pesquisa do Câncer. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Pesquisa do Câncer. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
