Generation af en lever Orthotopic humant Ukalvekød melanom xenograft platform i immundefekt mus
Summary
Ortotopisk humant lever metastatisk ukalvekød melanom xenograft musemodeller blev oprettet ved hjælp af kirurgiske ortotopiske implantations teknikker med patient-afledte tumor luns og nål injektion teknikker med kulturperler menneskelige ukalvekød melanom cellelinjer.
Abstract
I de seneste årtier, subkutant implanteret patient-afledte xenograft tumorer eller kulturperler menneskelige cellelinjer er blevet mere og mere anerkendt som mere repræsentative modeller til at studere menneskelige kræft i immundefekt mus end traditionelle etablerede humane celle linjer in vitro. Nylig, ortotopisk implanteret patient-afledte tumor xenograft (PDX) modeller i mus er blevet udviklet til bedre replikere funktioner af patientens tumorer. En lever ortotopisk xenograft musemodel forventes at være en nyttig kræftforskning platform, giver indsigt i tumor biologi og Drug Therapy. Men, lever ortotopisk tumor implantation er generelt kompliceret. Her beskriver vi vores protokoller for ortotopisk implantation af patient-afledte lever-metastatisk ukalvekød melanom tumorer. Vi dyrkede humane lever metastaserende ukalvekød melanom cellelinjer i immundefekt mus. Protokollerne kan resultere i konsekvent høje tekniske succesrater ved hjælp af enten en kirurgisk ortotopisk implantation teknik med bidder af patient-afledte ukalvekød melanom tumor eller en nål injektion teknik med kulturperler menneskelige cellelinje. Vi beskriver også protokoller for CT-scanning til at detektere indvendige levertumorer og for re-implantation teknikker ved hjælp af kryopræserverede tumorer at opnå re-engraftment. Sammen, disse protokoller giver en bedre platform for leveren ortotopisk tumor musemodeller af leveren metastatisk ukalvekød melanom i Translationel forskning.
Introduction
Ukalvekød melanom er den mest almindelige intraokulære maligne tumor blandt voksne i den vestlige verden. I løbet af de seneste 50 år, forekomsten af ukalvekød melanom (5,1 tilfælde per million) har været stabil i USA1,2. Ukalvekød melanom opstår fra melanocytter i iris, ciliære krop, eller choroid, og det er en ekstremt dødelig sygdom, når det udvikler metastase. Dødeligheden hos patienter med ukalvekød melanom metastase var 80% ved 1 år og 92% ved 2 år efter Initial diagnosticering af metastaser. Tiden mellem diagnosticering af metastaser og død er typisk kort, mindre end 6 måneder, uden hensyn til terapi3,4. Kræften spreder sig gennem blodet og har tendens til at overvejende metastaserer til leveren (89-93%)4,5. En effektiv musemodel er presserende behov for yderligere undersøgelse af lever-metastatisk ukalvekød melanom. For Translationel forskning, der er et klart krav om at generere en lever-lokaliseret metastatisk ukalvekød melanom musemodel.
Patient-afledte tumor xenograft (PDX) musemodeller forventes at give individualiserede medicin strategier. Disse modeller kan være prædiktiv for kliniske resultater, være nyttige for prækliniske Lægemiddelvurdering, og anvendes til biologiske undersøgelser af tumorer6. Repræsentative PDX-modeller er ektopisk tumor implanterede xenograft-mus, som har tumor på subkutane steder. De fleste forskere kan gøre kirurgi for subkutan implantation uden særlig praksis7,8. De kan også overvåge subkutane tumorer nemt. Selv om subkutane PDX-modeller blev populære i forskningsfasen, har de nogle forhindringer i at flytte til praktisk brug. Subkutan implantation tvinger patient-afledte tumorer til forankret i et andet mikromiljø fra tumoren oprindelse, således at det fører til engraftment fiasko og langsom tumorvækst 9,10,11, 12,13,14. Orthotopic engraftment kan være en mere ideel og rationel tilgang til en PDX-model, fordi det bruger det samme organ som den oprindelige tumor15,16.
For nylig har vi udviklet protokoller for kirurgiske ortotopiske implantations teknikker af patient-afledte lever-metastatisk ukalvekød melanom tumorer og nål injektion teknikker med en kulturperler menneskelige lever-metastatisk ukalvekød melanom cellelinje i NOD. CG-prkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) mus17,18. Protokollerne resulterer i konsekvent høje tekniske succesrater. Vi etablerede også CT-scanningsteknikker, der er nyttige til at detektere indvendige levertumorer, og vi udviklede re-implantation af kryopræserverede tumorer i PDX-platformen. Vi fandt, at ukalvekød melanom tumor xenograft modeller opretholde egenskaberne af den oprindelige patient lever tumor, herunder deres histopatologiske og molekylære egenskaber. Sammen, disse teknikker giver en bedre platform for leveren ortotopisk tumormodeller for ukalvekød melanom i Translationel forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nuværende ortotopisk xenograft-modeller er arbejdskraftintensive, tidskrævende og dyre at skabe. Orthotopic tumor xenograft musemodeller for leverkræft blev etableret mere end to årtier siden19,20,21. Men denne teknik er kompliceret og kræver brug af særligt udstyr, såsom en mikro-nål holder og 6-0 til 8-0 fine suturer under et mikroskop. Tumor og normal lever væv skal sys omhyggeligt, således at suturen ikke skader…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for M. Ohara, K. Saito og M. Terai, for at gennemgå manuskriptet. Forfatterne anerkender kritisk gennemgang for redaktionel og engelsk assistance af dette manuskript af Dr. R. Sato på Fox Chase Cancer Center. Det arbejde, der er beskrevet heri, blev støttet af Bonnie Kroll Research fund, Mark Weinzierl forskningsfond, Eye Melanoma forskningsfond på Thomas Jefferson University, Osaka community Foundation, og JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 hos Osaka City Universitet. Undersøgelser i Dr. A. Aplins laboratorium blev støttet af NIH Grant R01 GM067893. Dette projekt blev også finansieret af en Dean’s transformative Science Award, en Thomas Jefferson University programmatisk initiativ Award.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Referências
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Pesquisa do Câncer. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Pesquisa do Câncer. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Pesquisa do Câncer. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
