Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes
Summary
Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.
Abstract
En las últimas décadas, los tumores de xenoinjerto derivados del paciente o las líneas celulares humanas cultivadas se han reconocido cada vez más como modelos más representativos para estudiar los cánceres humanos en ratones inmunodeficientes que las células humanas establecidas tradicionales líneas in vitro. Recientemente, se han desarrollado modelos de xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) implantados ortotótológicamente en ratones para replicar mejor las características de los tumores de los pacientes. Se espera que un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico hepático sea una plataforma útil de investigación del cáncer, proporcionando información sobre la biología tumoral y la terapia farmacológica. Sin embargo, la implantación de tumores ortotópicos hepáticos es generalmente complicada. Aquí describimos nuestros protocolos para la implantación ortotópica de tumores de melanoma uveal de hígado-metastásico derivados del paciente. Cultivamos líneas celulares de melanoma uveal metastásico hepático humano en ratones inmunodeficientes. Los protocolos pueden dar lugar a tasas de éxito técnico consistentemente altas utilizando una técnica de implantación ortotópica quirúrgica con trozos de tumor de melanoma uveal derivado del paciente o una técnica de inyección de aguja con línea celular humana cultivada. También describimos protocolos para la exploración por TC para detectar tumores hepáticos interiores y para técnicas de reimplantación utilizando tumores crioconservados para lograr el reinjerto. Juntos, estos protocolos proporcionan una mejor plataforma para los modelos de ratón tumor ortotópico hepático de melanoma uveal metastásico hepático en la investigación traslacional.
Introduction
El melanoma veal es el tumor maligno intraocular más común entre los adultos en el mundo occidental. Durante los últimos 50 años, la incidencia de melanoma uveal (5,1 casos por millón) se ha mantenido estable en los Estados Unidos1,2. El melanoma veal surge de melanocitos en el iris, cuerpo ciliar o coroides, y es una enfermedad extremadamente letal cuando desarrolla metástasis. La tasa de mortalidad de los pacientes con metástasis de melanoma uveal fue del 80% a 1 año y del 92% a los 2 años después del diagnóstico inicial de las metástasis. El tiempo entre el diagnóstico de metástasis y la muerte suele ser corto, menos de 6 meses, sin tener en cuenta la terapia3,4. El cáncer se propaga a través de la sangre y tiende a hacer metástasis dominantes en el hígado (89-93%)4,5. Se necesita urgentemente un modelo de ratón eficaz para una investigación más profunda del melanoma uveal hepático-metastásico. Para la investigación traslacional, existe una clara demanda para generar un modelo de ratón de melanoma uveal metastásico localizado en el hígado.
Se espera que los modelos de ratón de xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) proporcionen estrategias de medicina individualizada. Estos modelos pueden ser predictivos de los resultados clínicos, ser útiles para la evaluación de fármacos preclínicos y ser utilizados para estudios biológicos de tumores6. Los modelos PDX representativos son ratones xenoinjertos implantados con tumores ectopáticamente, que tienen tumor en sitios subcutáneos. La mayoría de los investigadores pueden hacer cirugía para la implantación subcutánea sin práctica especial7,8. También pueden controlar los tumores subcutáneos fácilmente. Aunque los modelos PDX subcutáneos se hicieron populares en la fase de investigación, tienen algunos obstáculos para pasar a su uso práctico. La implantación subcutánea obliga a los tumores derivados del paciente a injertaren en un microambiente diferente del origen tumoral, de modo que conduce a la insuficiencia del injerto y al crecimiento lento del tumor 9,10,11, 12,13,14. El injerto ortotópico puede ser un enfoque más ideal y racional para un modelo PDX porque utiliza el mismo órgano que el tumor original15,16.
Recientemente, desarrollamos protocolos para técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica de tumores de melanoma uveal de hígado-metastásico derivados del paciente y técnicas de inyección de agujas con una línea celular de melanoma uveal hígado-metastásico humano cultivado en NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones17,18. Los protocolos dan como resultado tasas de éxito técnico consistentemente altas. También establecimos técnicas de tomografía computarizada que son útiles para detectar tumores hepáticos interiores, y desarrollamos la reimplantación de tumores crioconservados en la plataforma PDX. Encontramos que los modelos de xenoinjerto tumoral de melanoma uveal mantienen las características del tumor hepático del paciente original, incluyendo sus características histopatológicas y moleculares. Juntos, estas técnicas proporcionan una mejor plataforma para modelos de tumores ortotópicos hepáticos para el melanoma uveal en la investigación traslacional.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos de xenoinjerto ortotópicos actuales son intensivos en mano de obra, requieren mucho tiempo y son costosos de crear. Modelos de ratón xenoinjerto tumoral para el cáncer de hígado se establecieron hace más de dos décadas19,20,21. Sin embargo, esta técnica es complicada y requiere el uso de equipos especiales, como un soporte de microagujas y de 6-0 a 8-0 suturas finas bajo un microscopio. El tumor y el tejido he…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a M. Ohara, K. Saito y M. Terai, por revisar el manuscrito. Los autores reconocen la crítica para la asistencia editorial y en inglés de este manuscrito por el Dr. R. Sato en Fox Chase Cancer Center. El trabajo descrito aquí fue apoyado por el Bonnie Kroll Research Fund, el Mark Weinzierl Research Fund, el Eye Melanoma Research Fund en La Universidad Thomas Jefferson, the Osaka Community Foundation y JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 en Osaka City Universidad. Los estudios en el laboratorio del Dr. A. Aplin fueron apoyados por la subvención de NIH R01 GM067893. Este proyecto también fue financiado por un Dean’s Transformative Science Award, un Premio de la Iniciativa Programática de la Universidad Thomas Jefferson.
Materials
| Materials, tissues and animals | |||
| Buprenorphine | |||
| CO2 tank | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1X, with calcium & magnesium | Corning | 21-020-CM | |
| Human liver metastatic uveal melanoma cell line | |||
| Human uveal melanoma tissue in the liver | All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections. | ||
| Iodine | |||
| Isoflurane | Purdue Products | 67618-150-17 | |
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent. |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Lab | 5557 | 4 to 8 weeks old |
| PBS 1X, without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) | Nice-Pak products | B603 | |
| 4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | Wako | 163-20145 | |
| 70% Ethyl alcohol solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Absorbable hemostat | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Body weight measure | |||
| Cautery | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Cell counter | |||
| Centrifuzer | |||
| Cotton swab | |||
| Cryo freezing container | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Curved scissors | World Precision Instruments | 503247 | |
| Curved ultrafine forceps | World Precision Instruments | 501302 | |
| Fabric sheet | |||
| Freezer | |||
| F/AIR Filter Canister | Harvard Apparatus | 600979 | |
| Heating pad | |||
| Isoflurane vaporizer | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Liquid nitrogen jar | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Needle holder | World Precision Instruments | 501246 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipette | |||
| Spray bottle | |||
| Sterile hood | Biosafety level 2 cabinet | ||
| Sterile No.11 scalpel | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Straight forceps | World Precision Instruments | 14226 | |
| Surgical drape | |||
| Tail vein restrainer | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Water bath | |||
| 1 ml TB syringe with 27-gauge needle | BD | 309623 | |
| 1.7 ml tube | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Suture | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| 27-gauge needle | BD | 780301 | |
| 27-gauge needle | Hamilton | 7803-01 | |
| 50 mL conical tubes | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µl micro syringe | BD | 80630 | |
| 50 µl micro syringe | Hamilton | 7655-01 | |
| 100 mL container | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μl tip |
Referências
- Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4 (3), 145-151 (2018).
- Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
- Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98 (3), 383-389 (1991).
- Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123 (12), 1639-1643 (2005).
- Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119 (5), 670-676 (2001).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2352-2362 (2010).
- Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3 (3), 413-422 (1993).
- Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1 (3), 471-475 (2010).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14 (20), 6456-6468 (2008).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3 (5-6), 469-482 (2009).
- Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15 (8), 451-452 (2015).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (2), 217-221 (2009).
- Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186 (1), 43-56 (2016).
- Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 145 (2017).
- Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (20), 9345-9349 (1991).
- Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6 (6), 2556-2561 (2000).
- Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Pesquisa do Câncer. 72 (10), 2683-2691 (2012).
- Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25 (79), e50544 (2013).
- Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46 (4), 1186-1190 (2014).
- Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
- Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6 (9), e25692 (2011).
- Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14 (5), 574-583 (2012).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Pesquisa do Câncer. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Pesquisa do Câncer. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6 (5), 14495 (2015).
