हम चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं को मज़बूती से उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं और विट्रो और वीवो में उनके भेदभाव और कार्य का परीक्षण करते हैं।
दत्तक इम्यूनोथेरेपी कैंसर और संक्रामक रोग के इलाज के लिए वादा रखती है । हम चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) के साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और उनकी संतान पूर्व वीवो का विस्तार करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हम कार अभिव्यक्ति के साथ ही भेदभाव, प्रसार क्षमता और साइटोलिटिक गतिविधि को मापने के लिए परख शामिल हैं । हम कार टी कोशिकाओं में प्रभावक साइटोकिन उत्पादन और भड़काऊ साइटोकिन स्राव को मापने के लिए परखों का वर्णन करते हैं। हमारा दृष्टिकोण दत्तक इम्यूनोथेरेपी के प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए संस्कृति कार टी कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय और व्यापक विधि प्रदान करता है।
चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) अलग ट्यूमर एंटीजन के खिलाफ टी कोशिकाओं को रीडायरेक्ट करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। सीएआर सिंथेटिक रिसेप्टर्स हैं जो एंटीजन लक्ष्य को बांधते हैं। जबकि उनकी सटीक संरचना चर है, CARs आम तौर पर 3 अलग डोमेन होते हैं । एक्सट्रासेल्युलर डोमेन एक लक्ष्य एंटीजन के लिए बाध्यकारी निर्देश देता है और आमतौर पर एक एक्सट्रासेलुलर काज के माध्यम से कार से जुड़े एक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े से जुड़ा होता है। दूसरा डोमेन, आमतौर पर टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) परिसर की सीडी 30 श्रृंखला से प्राप्त, कार सगाई के बाद टी सेल सक्रियण को बढ़ावा देता है। टी सेल फ़ंक्शन, एनग्राफमेंट, चयापचय और दृढ़ता को बढ़ाने के लिए एक तीसरा सह-ात्मक डोमेन शामिल है। बी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (सभी), क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएएलएल) और मल्टीपल मायलोमा सहित विभिन्न हेमेटोपोइटिक घातक क्षमताओं मेंकार टी सेल थेरेपी की सफलता1,2,3,4,5,6सहित विभिन्न हेमेटोपोइटिक घातक क्षमताओं में कार टी सेल थेरेपी की सफलता इस दृष्टिकोण के चिकित्सीय वादे पर प्रकाश डालती है । हाल ही में खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) दो CD19-विशिष्ट कार टी सेल चिकित्सा, बाल चिकित्सा और युवा वयस्क सभी और फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा के लिए axicabtagenecil के लिए tisagenlecleucel के लिए मंजूरी, कार टी सेल थेरेपी के अनुवाद योग्यता पुष्ट ।
कार टी आधारित दृष्टिकोण परिधीय रक्त, सक्रियण, आनुवंशिक संशोधन, और विस्तार पूर्व वीवो से टी कोशिकाओं के अलगाव शामिल हैं । विभेदन कार टी सेल प्रभावकारिता को विनियमित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। तदनुसार, पूर्व वीवो संस्कृति के दौरान टी सेल भेदभाव को प्रतिबंधित करना संक्रमित उत्पादकी2, 7,8,9के बाद दीर्घकालिक इम्यूनोससर्वेशन प्रदान करने की क्षमता को बढ़ाता है। टी कोशिकाओं सहित कई अलग-अलग सबसेट शामिल हैं: भोली टी कोशिकाएं (टीएन), केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), प्रभावक स्मृति (टेम), प्रभावक विभेदित (टीटीई) और स्टेम सेल मेमोरी (टीसीएम)। प्रभावक विभेदित टी कोशिकाओं में शक्तिशाली साइटोलिटिक क्षमता होती है; हालांकि, वे कम रहते थे और खराब10,11,12engraft हैं . इसके विपरीत, भोली टी कोशिकाओं और टीसीएम सहित कम विभेदित फेनोटाइप वाली टी कोशिकाएं दत्तक कोशिका हस्तांतरण13,14,15,16,17,18के बाद बेहतर एनग्राफमेंट और प्रोलिजिरेटिव क्षमताओं का प्रदर्शन करती हैं। पूर्व निर्मित उत्पाद में एकत्र टी कोशिकाओं की संरचना रोगियों में भिन्न हो सकती है और कार टी कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता के साथ सहसंबंधित है। शुरू करने वाले एफेरेसिस उत्पाद में भोले की तरह इम्यूनोफेनोटाइप वाली टी कोशिकाओं का अनुपात एनग्राफमेंट और नैदानिक प्रतिक्रियादोनोंके साथ अत्यधिक सहसंबद्ध है।
संस्कृति अवधि दत्तक हस्तांतरण के लिए तैयार कार टी कोशिकाओं में भेदभाव को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। हमने हाल ही में एक संक्षिप्त संस्कृति प्रतिमान20का उपयोग करके बेहतर गुणवत्ता वाले कार टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया । हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि सीमित संस्कृति ल्यूकेमिया के विद्वेष मॉडलों में दत्तक हस्तांतरण के बाद बेहतर प्रभावक समारोह और दृढ़ता के साथ कार टी कोशिकाओं को जन्म देती है। यहां, हम लेडो19 कोशिकाओं (सीडी 3 और 4-1बीबी सिग्नलिंग डोमेन से जुड़े एंटी-सीडी19 एससीएफवी को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर ऑटोलोगस टी कोशिकाओं) को मज़बूती से उत्पन्न करने के दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं और इसमें उन परखों का विस्तृत विवरण शामिल है जो दत्तक हस्तांतरण से पहले कार टी बायोएक्टिविटी और प्रभावकारिता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
यहां हम पूर्व वीवो संस्कृति में अलग-अलग अंतराल पर काटे गए कार टी कोशिकाओं के कार्य और प्रभावकारिता को मापने के लिए दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। हमारे तरीके प्रोलिफेरेटिव क्षमता के साथ-साथ विट्रो मे?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय (माइकल सी Milone) के साथ ही सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार (सबा घोसेमी) के साथ एक अनुसंधान गठबंधन के माध्यम से नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स द्वारा प्रदान की गई फंडिंग के माध्यम से भाग में समर्थित किया गया था ।
Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |