ייצור בצ הקולטן אנטיגן (רכב) T תאים לטיפול חיסוני המאמצת
Summary
אנו מתארים גישה מהימנה ליצור הקולטן אנטיגן הצ (רכב) T תאים ולבדוק בידול שלהם ותפקוד מבחנה בvivo.
Abstract
חיסוני המאמצת מחזיקה הבטחה לטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. אנו מתארים גישה פשוטה לשנות את התאים הראשוניים של האדם הראשי עם קולטן אנטיגן צ’יאריק (רכב) ולהרחיב את הצאצאים שלהם לשעבר vivo. אנו כוללים בחני למדוד ביטוי רכב, כמו גם בידול, קיבולת ההתרבות ופעילות cytolytic. אנו מתארים בחני למדוד את הייצור cy, ציטוקין והפרשת ציטוקין דלקתיים בתאי T רכב. הגישה שלנו מספקת שיטה אמינה ומקיפה לתאי T מכונית התרבות עבור מודלים פרה-קליניים של טיפול חיסוני המאמצת.
Introduction
הקולטנים אנטיגן הצ (מכוניות) לספק גישה מבטיחה לנתב מחדש את תאי T נגד אנטיגנים הגידול ברורים. מכוניות הם קולטנים סינתטיים כי לאגד מטרה אנטיגן. בעוד הרכב המדויק שלהם הוא משתנה, מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים שונים. תחום החילוץ מורה כריכת אנטיגן היעד הוא מורכב בדרך כלל קטע נוגדן שרשרת אחת המקושרת למכונית באמצעות ציר מסחטות. התחום השני, הנגזר בדרך כלל משרשרת CD3ζ של קולטן תא T (TCR) מורכב, מקדמת הפעלת תא T לאחר האירוסין רכב. תחום מגירוי שלישי כלול כדי לשפר את תפקוד התא T, העפילה, חילוף החומרים והתמדה. ההצלחה של המכונית טיפול בתאי T ב ממאירות המטפאות שונים כולל B לוקמיה לימפובלסטית חריפה (כל), לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) ומיאלומה נפוצה מדגיש את ההבטחה הטיפולית של גישה זו1,2,3,4,5,6. המזון והתרופות האחרונות (FDA) אישורים עבור שתי CD19-ספציפיים מכונית T טיפולים, tisagenlecleucel עבור ילדים ובוגרים צעירים ALL ו-axicabtagene עבור לימפומה מפוזר תא B גדול, מחזקת את הכשרון הטרנסלאליות של טיפול בתאי T מכונית.
שיטות T מבוססות מכונית כרוכות בבידוד של תאי T מ דם היקפי, הפעלה, שינוי גנטי, והרחבת ex vivo. בידול הוא פרמטר חשוב הוויסות מכונית T יעילות תאים. בהתאם לכך, הגבלת בידול תא T במהלך התרבות vivo ex מגביר את היכולת של המוצר המוחדרת כדי חרט, להרחיב, ולהמשיך, מתן מעקב לטווח ארוך החיסונית בעקבות העברה המאמצת2,7,8,9. תאי t מורכבים ממספר קבוצות מערכות ברורות כולל: תאי T תמימים (Tn), זיכרון מרכזי (Tcm), זיכרון אפקטור (Tem), אפקטור הבדיל (Tte) וזיכרון תא גזע (Tscm). אפקטור הבדיל תאים T יש יכולת cytolytic חזקה; עם זאת, הם קצרים חיו והוא חרט גרוע10,11,12. לעומת זאת, תאים t עם הפנוטיפ פחות הבדיל כולל תאי T תמים ו Tcm התערוכה מעולה בתיאום ויכולות ההתרבות בעקבות העברת התא המאמצת13,14,15,16,17,18. הרכב של תאי T שנאספו במוצר שיוצרו מראש יכול להשתנות ברחבי החולים והתואם את הפוטנציאל התרפויטי של מכונית T. היחס של תאי T עם הimmunophenotype נאיבי כמו המוצר המתחיל apheresis הוא מתאם מאוד עם השני והתגובה הקלינית של התשובה19.
משך התרבות הוא פרמטר חשוב המשפיע על בידול בתאי T רכב מוכן העברה המאמצת. פיתחנו לאחרונה גישה כדי ליצור באיכות מעולה בתאי T מכונית באמצעות פרדיגמה תרבות מקוצרת20. באמצעות הגישה שלנו, הראנו כי תרבות מוגבלת מעניקה העלייה לתאי T רכב עם פונקציה מעולה אפקטור והתמדה בעקבות העברה המאמצת במודלים מבע של לוקמיה. כאן, אנו מציגים את הגישות לייצר באופן אמין CART19 תאים (בתאי T אוטוולוגיים הנדסה כדי לבטא anti-CD19 scfv מצורף CD3ζ ו 4-1bb התחומים איתות) וכוללים תיאור מפורט של בחני כי לספק תובנה לתוך מכונית ביולוגי T ויעילות לפני העברה המאמצת.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים גישות למדוד את הפונקציה ואת היעילות של תאי T רכב שנקטפו במרווחי זמן שונים ברחבי התרבות vivo ex. השיטות שלנו מספקות תובנה מקיפה לתוך בחני שנועדה להעריך את הקיבולת ההתרבות, כמו גם את התפקוד של אפקטור בתוך מבחנה. אנו מתארים כיצד למדוד פעילות תא T המכונית בעקבות גירוי דרך המכונית ופר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו באמצעות מימון שסופקו על ידי התרופות נוברטיס באמצעות ברית מחקר עם אוניברסיטת פנסילבניה (מייקל C. Milone), כמו גם את פרס מלומד בקרן סנט בלדריק (סאבא Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
Referências
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
