Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie
Summary
We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.
Abstract
Adoptie immunotherapie is veelbelovend voor de behandeling van kanker en infectieziekten. We beschrijven een eenvoudige benadering om primaire menselijke T-cellen te leiden met een chimerische antigeen receptor (auto) en hun nageslacht ex vivo uit te breiden. We nemen assays op om auto-expressie te meten, evenals differentiatie, proliferatieve capaciteit en cytolytische activiteit. We beschrijven assays meten Effector cytokine productie en inflammatoire cytokine secretie in auto T-cellen. Onze aanpak biedt een betrouwbare en uitgebreide methode voor cultuur auto T-cellen voor preklinische modellen van adoptie immunotherapie.
Introduction
Chimeric antigeen receptoren (Auto’s) bieden een veelbelovende aanpak om te leiden T-cellen tegen verschillende tumor antigenen. Auto’s zijn synthetische receptoren die een antigeen doelwit binden. Hoewel hun precieze samenstelling variabel is, bevatten Auto’s over het algemeen 3 verschillende domeinen. Het extracellulaire domein leidt binding aan een doel antigeen en bestaat meestal uit een single Chain antilichaam fragment gekoppeld aan de auto via een extracellulaire scharnier. Het tweede domein, vaak afgeleid van de CD3ζ keten van het T Cell receptor (TCR) complex, bevordert de activering van de T-cel na de betrokkenheid van de auto. Een derde costimulatory domein is opgenomen ter verbetering van de functie van de T-cel, engraftment, metabolisme, en persistentie. Het succes van auto T-cel therapie in verschillende hematopoietische maligniteiten, waaronder B-cel acute lymfoblastische leukemie (alle), chronische lymfatische leukemie (CLL) en multipel myeloom wijst op de therapeutische belofte van deze aanpak1,2,3,4,5,6. De recente Food and Drug Administration (FDA) goedkeuringen voor twee CD19-specifieke CAR T Cell therapieën, tisagenlecleucel voor pediatrische en jong volwassen ALL en axicabtagene ciloleucel voor diffuus groot B-cel lymfoom, versterkt de translationele verdienste van auto T-cel therapie.
AUTO T-gebaseerde benaderingen omvatten het isoleren van T-cellen van perifeer bloed, activering, genetische modificatie en expansie ex vivo. Differentiatie is een belangrijke parameter die de werkzaamheid van de CAR T cel regelt. Daarom versterkt het beperken van de celdifferentiatie tijdens de ex vivo-cultuur het vermogen van het geïnfundeerd product om te graveren, uit te breiden en te blijven bestaan, waardoor lange termijn immunosurveillance wordt gegeven na adoptie overdracht2,7,8,9. T-cellen bestaan uit verschillende afzonderlijke subsets, waaronder: naïeve T-cellen (TN), centraal geheugen (TCM), Effector-geheugen (TEM), Effector-gedifferentieerd (TTE) en stamcel geheugen (TSCM). Effector gedifferentieerde T cellen hebben krachtige cytolytische vermogen; ze zijn echter van korte duur en graveren slecht10,11,12. T-cellen met een minder gedifferentieerd fenotype, met inbegrip van naïeve T-cellen en TCM vertonen daarentegen superieure engraftment en proliferatieve vaardigheden na adoptie van celoverdracht13,14,15,16,17,18. De samenstelling van de verzamelde T-cellen in het Voorgefabriceerde product kan variëren tussen patiënten en correleert met het therapeutische potentieel van auto T-cellen. Het aandeel van T-cellen met een naïef immunoffenol type in het startende aferese product is sterk gecorreleerd met zowel engraftment als klinische respons19.
Cultuur duur is een belangrijke parameter die de differentiatie in auto T-cellen voorbereid voor adoptie overdracht beïnvloedt. We hebben onlangs een aanpak ontwikkeld voor het genereren van superieure kwaliteit auto T-cellen met behulp van een verkorte cultuur paradigma20. Met behulp van onze aanpak, we toonden dat beperkte cultuur geeft aanleiding tot auto T cellen met superieure Effector functie en persistentie na adoptie overdracht in xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie. Hier presenteren we de benaderingen om betrouwbaar te genereren CART19 cellen (autologe T cellen ontworpen om uit te drukken anti-CD19 scFv gekoppeld aan CD3ζ en de 4-1BB signalering van domeinen) en bevatten een gedetailleerde beschrijving van de assays die inzicht geven in auto T bioactiviteit en werkzaamheid voorafgaand aan adoptie overdracht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de benaderingen voor het meten van de functie en werkzaamheid van auto-T-cellen die met verschillende intervallen worden geoogst in de ex vivo-cultuur. Onze methoden bieden uitgebreid inzicht in assays die zijn ontworpen om proliferatieve capaciteit en Effector functie in vitro te beoordelen. We beschrijven hoe te meten auto t cel activiteit na stimulatie door de auto en detail xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie met behulp van auto t cellen geoogst op dag 3 vs dag 9 van hun logaritmisc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gesteund door middel van financiering door Novartis Pharmaceuticals via een onderzoeksinfrastructuur met de Universiteit van Pennsylvania (Michael C. Milone) en de St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
Referências
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
