Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive
Summary
Nous décrivons une approche pour générer fiable des cellules T de récepteur d’antigène chimérique (CAR) et testons leur différenciation et fonction in vitro et in vivo.
Abstract
L’immunothérapie adoptive est prometteuse pour le traitement du cancer et des maladies infectieuses. Nous décrivons une approche simple pour transduire les lymphocytes T humains primaires avec le récepteur chimérique d’antigène (CAR) et d’étendre leur progéniture ex vivo. Nous incluons des essais pour mesurer l’expression de la RCA ainsi que la différenciation, la capacité de prolifération et l’activité cytolytique. Nous décrivons des essais pour mesurer la production de cytokine effectrice et la sécrétion inflammatoire de cytokine dans les cellules T de CAR. Notre approche fournit une méthode fiable et complète pour la culture des cellules T CAR pour les modèles précliniques d’immunothérapie adoptive.
Introduction
Les récepteurs d’antigène chimérique (RAC) fournissent une approche prometteuse pour rediriger des cellules de T contre des antigènes distincts de tumeur. Les RAC sont des récepteurs synthétiques qui lient une cible antigène. Bien que leur composition précise soit variable, les RAC contiennent généralement 3 domaines distincts. Le domaine extracellulaire dirige la liaison vers un antigène cible et est généralement composé d’un fragment d’anticorps à chaîne unique relié à la RCA via une charnière extracellulaire. Le deuxième domaine, généralement dérivé de la chaîne CD3du du complexe du récepteur des lymphocytes T (TCR), favorise l’activation des lymphocytes T après l’engagement de la RCA. Un troisième domaine costimulatory est inclus pour améliorer la fonction de cellule T, l’engraftment, le métabolisme, et la persistance. Le succès de la thérapie cellulaire t CAR dans diverses malignités hématopoïétiques, y compris la leucémie lymphoblastique aigue à cellules B (LAL), la leucémie lymphocytique chronique (LCL) et le myélome multiple met en évidence la promesse thérapeutique de cette approche1,2,3,4,5,6. Les approbations récentes de la Food and Drug Administration (FDA) pour deux thérapies à cellules T CAR spécifiques à la Car19, le tisagenlecleucel pour les patients atteints de l’ENSEMBLE pédiatrique et des jeunes adultes et du ciloleucel d’axicabtagene pour le lymphome diffus à grandes cellules B, renforce le mérite translationnel de la thérapie cellulaire T de la RCA.
Les approches basées sur le CAR T impliquent l’isolement des lymphocytes T du sang périphérique, l’activation, la modification génétique et l’expansion ex vivo. La différenciation est un paramètre important régulant l’efficacité des lymphocytes T CAR. En conséquence, la restriction de la différenciation des lymphocytes T pendant la culture ex vivo améliore la capacité du produit infusé à s’engrafter, à se développer et à persister, fournissant une immunosurveillance à long terme après le transfert adoptif2,7,8,9. Les lymphocytes T se composent de plusieurs sous-ensembles distincts, y compris : les lymphocytes T naïfs (Tn), la mémoire centrale (Tcm), la mémoire effectrice (Tem), l’effecteur différencié (Tte) et la mémoire des cellules souches (Tscm). Les lymphocytes T différenciés de l’Effecteur ont une capacité cytolytique puissante; cependant, ils sont de courte durée et engraft mal10,11,12. En revanche, les lymphocytes T avec un phénotype moins différencié comprenant les lymphocytes T naïfs et les Tcm présentent des capacités supérieures d’engraftment et de prolifération suivant le transfert adoptif de cellule13,14,15,16,17,18. La composition des lymphocytes T collectés dans le produit préfabriqué peut varier d’un patient à l’autre et est en corrélation avec le potentiel thérapeutique des lymphocytes T CAR. La proportion de lymphocytes T avec un immunophénotype naïf-comme dans le produit d’apheresis de départ est fortement corrélée avec l’engraftment et la réponse clinique19.
La durée de la culture est un paramètre important influençant la différenciation dans les cellules T CAR préparées pour le transfert adoptif. Nous avons récemment développé une approche pour générer des cellules T CAR de qualité supérieure en utilisant un paradigme de culture abrégé20. En utilisant notre approche, nous avons montré que la culture limitée donne lieu à des cellules T CAR avec la fonction effectrice supérieure et la persistance suivant le transfert adoptif dans les modèles de xénogreffe de la leucémie. Ici, nous présentons les approches pour générer de façon fiable des cellules CART19 (cellules T autologues conçues pour exprimer l’anti-CD19 scFv attaché à CD3 et les domaines de signalisation 4-1BB) et incluons une description détaillée des essais qui fournissent un aperçu de la bioactivité et de l’efficacité de CAR T avant le transfert adoptif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous décrivons des approches pour mesurer la fonction et l’efficacité des cellules T de CAR récoltées à des intervalles variables tout au long de la culture ex vivo. Nos méthodes fournissent un aperçu complet des essais conçus pour évaluer la capacité de prolifération ainsi que la fonction effector in vitro. Nous décrivons comment mesurer l’activité des lymphocytes T carracinés par stimulation par le CAR et détaillons les modèles de xénogreffe de la leucémie à l’aide de cellules T CAR récoltées a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le financement fourni par Novartis Pharmaceuticals par le biais d’une alliance de recherche avec l’Université de Pennsylvanie (Michael C. Milone) ainsi que st. Baldrick’s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
Referências
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