Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.
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Artigo de método
Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio do cometa está ganhando popularidade como um meio de avaliar os danos do DNA em células e tecidos cultivados, particularmente após a exposição a produtos químicos ou outros estressores ambientais. O uso do ensaio do cometa em testes regulatórios para potencial genotóxico em roedores foi impulsionado pela adoção de uma diretriz de teste da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) em 2014. Os slides de ensaio de cometasão normalmente preparados a partir de tecido fresco no momento da necropsia; no entanto, o congelamento de amostras de tecidos pode evitar desafios logísticos associados à preparação simultânea de slides de múltiplos órgãos por animal e de muitos animais por estudo. O congelamento também permite o envio de amostras da instalação de exposição para um laboratório diferente para análise, e o armazenamento de tecido congelado facilita o adiamento da decisão de gerar dados de danos de DNA para um determinado órgão. O ensaio de cometa alcalino é útil para detectar quebras de DNA de dna e fio único relacionados à exposição, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios associadas com o reparo incompleto da excisão do DNA. No entanto, os danos no DNA também podem resultar de procedimentos mecânicos de cisalhamento ou processamento de amostras inadequados, confundindo os resultados do ensaio. A reprodutibilidade na coleta e processamento de amostras de tecidos durante necropsias pode ser difícil de controlar devido à flutuação de pessoal de laboratório com diferentes níveis de experiência na colheita de tecidos para o ensaio do cometa. Aumentar a consistência através do treinamento de atualização ou implantação de unidades móveis com pessoal de laboratório experiente é caro e nem sempre pode ser viável. Para otimizar a geração consistente de amostras de alta qualidade para análise de ensaios de cometas, foi avaliado um método para homogeneizar cubos de tecido congelados flash usando um dispositivo de picar tecido personalizado. Amostras preparadas para o ensaio do cometa por este método comparadas favoravelmente em qualidade a amostras de tecido fresco e congelado preparadas por picar durante a necropsia. Além disso, o dano baixo do DNA da linha de base foi medido em células de cubos congelados de tecido após armazenamento prolongado.
Introdução
O ensaio do cometa é cada vez mais usado como um meio de avaliar os danos do DNA em células cultivadas e tecidos expostos a produtos químicos ou outros estressores ambientais1. O ensaio pode detectar quebras de DNA duplo e único, lesões alcalinas-labiles e quebras de fios únicos associadas ao reparo incompleto do DNA. O Conselho Internacional de Harmonização dos Requisitos Técnicos para Medicamentos para Uso Humano (ICH) para testes farmacêuticos recomenda um ensaio de quebra de fios de DNA, como o ensaio do cometa como um segundo teste para complementar o ensaio do micronúcleo eritrócito de roedores para avaliação da genotoxicidade in vivo e c....
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Protocolo
Os tecidos foram colhidos durante a realização de estudos realizados em instalações credenciadas pela AAALAC nos laboratórios de contratos da NTP, de acordo com as normas de Boa Prática laboratorial (21 CFR Parte 58) e protocolos de uso animal aprovados pelo Animal Institucional Comitê de Cuidado e Uso (IACUC) em cada laboratório.
1. Colheita e Processamento de Tecidos
NOTA: É útil preparar tubos de amostra duplicados (por exemplo, fígado) ou transferir aproximadamente metade de uma amostra para outro tubo de armazenamento (por exemplo, duodeno, estômago) para permitir a reanálise, se necessário. P....
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Resultados
Estudo 1
Fígado foi colhido de duas coortes de ratos machos de Sprague Dawley administrados óleo de milho por 4 dias, escalonados por uma semana. Slides foram preparados a partir de tecido recém-picado, tecido picado congelado e tecido em cubos congelados processados na solução média ou picada de Merchant usando o dispositivo de picar tecido. Os tecidos congelados obtidos de animais da primeira coorte foram avaliados após o armazenamento do congelador por ~3,5 meses. Os tecidos congelados obtidos de a.......
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Discussão
Como demonstrado anteriormente7,12,13, tecido picado congelado flash devidamente manuseado fornece bons resultados no ensaio do cometa. De fato, os valores de DNA da cauda % da linha de base para fígado de rato picado congelado e fígado de rato preparado em nosso laboratório são tipicamente ≤6%, conforme recomendado pela diretriz de teste da OCDE9 para amostras de fígado de rato recém-picado. Bons resulta.......
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Divulgações
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental (NIEHS) contrato HHS27320130000c; no entanto, as declarações, opiniões ou conclusões nela contidas não representam necessariamente as declarações, opiniões ou conclusões do NIEHS, NIH ou do governo dos Estados Unidos.
Agradecimentos
Os autores estão em dívida com Lincoln Martin e Kelley Owens por assistência técnica especializada preparando e pontuando slides de cometas e dr. Carol Swartz para a realização de análises estatísticas. Os autores também reconhecem as contribuições solidárias dos membros dos programas de Toxicologia Genética, Toxicologia Investigativa e Necropsia do ILS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cryovials | Corning Costar | 430488 | |
| Folhas de Cera Dental | Microscopia Eletrônica Ciências | 72670 | |
| Dissecando (Picando) Micro Tesoura | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Hank's Solução Salina Balanceada | Gibco | 14175-079 | |
| KCl | Teknova | P0315-10 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Baixo Ponto de Fusão Agarose | Lonza | 50081 | |
| Tubos Microfuge (1,7 mL) | Corning | 3207 | |
| Na2EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Na2 HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| Leica | 600 | Tamponada Neutra Plunger | |
| Seringa | Miltex | 4-110 | |
| (1 mL) | Fisher Scientific ou Vitality Medical | 14-826-88; Seringa de | tuberculina 8881901014 Becton Dickinson ou Monoject |
| Dispositivo de picagem de tecido | NorGenoTech (Oslo, Noruega) | Nenhum | Pequena variabilidade no diâmetro observada que pode afetar o conforto do êmbolo. |
| Pinças, plástico | Trade Winds Direct | DF8088N | Nylon reforçado, não estéril, ponta romba, autoclavável; tradewindsdirect.com |
| Barcos de Pesagem | Krackler Scientific/Heathrow Scientific | 6290-14251B |
Referências
- van der Leede, B. J., et al. Performance and data interpretation of the in vivo comet assay in pharmaceutical industry: EFPIA survey results. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 775-776, 81-88 (2014).
- ICH.
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Reimpressões e permissões
