Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen
Summary
Ein genauer und robuster, auf Polymerasekettenreaktion basierender Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen im Fragile X-Gen für geistige Retardierung-1 erleichtert die molekulare Diagnose und das Screening des Fragile X-Syndroms und des fragilen X-bezogenen Störungen mit kürzerer Umschaltzeit und Investitionen in Ausrüstung.
Abstract
Fragiles X-Syndrom (FXS) und damit verbundene Störungen werden durch die Ausdehnung des Cytosin-Guanin-Guanin-Guin-Tricleid-Repeats (CGG) in der5′ unübersetzten Region (UTR) des fragilen X-Genpromotors verursacht. Konventionell wird die Kapillarelektrophoresefragmentanalyse auf einem genetischen Analysator für die Dimensionierung der CGG-Wiederholungen von FMR1verwendet, aber für die genaue Messung, wenn die Wiederholungszahl höher als 200 ist, ist eine zusätzliche Südfleckanalyse erforderlich. Hier stellen wir eine genaue und robuste Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen in der 5’UTR des FMR1-Promotors mit einem Fragile X PCR-Kit, gefolgt von der Reinigung der PCR-Produkte und der Fragmentierung auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument, und anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen durch Verweise auf Standards mit bekannten Wiederholungen mithilfe der Analysesoftware. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, die gesamte Bandbreite der CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotoren zu identifizieren, einschließlich derjenigen mit einer Wiederholungszahl von mehr als 200 (klassifiziert als vollständige Mutation), 55 bis 200 (Vormutation), 46 bis 54 (Zwischen- und 10 bis 45 (normal). Es ist eine kostengünstige Methode, die die Klassifizierung der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen mit Robustheit und schneller Berichtszeit erleichtert.
Introduction
Fragiles X-Syndrom (FXS) und fragile X-assoziierte Erkrankungen, z. B. Tremor- und Ataxie-Syndrom (FX-TAS), und primäre Ovarialinsuffizienz (FX-POI) werden hauptsächlich durch Cytosin-Guanin-Guanin (CGG) Trinukleotid-Wiederholungsexpansion in der 5′ unübersetzten (UTR) des fragilen X-Gens für geistige Retardierung-1 (FMR1) auf Xq27.31,2. Das FMR1-kodierte Protein (FMRP) ist ein polyribosom-assoziiertes RNA-bindendes Protein, das in der neuronalen Entwicklung und synaptischen Plastizität funktioniert, indem es alternative Spleiß-, Stabilitäts- und dendritische Transporte von mRNA oder modulierender Synthese reguliert. von partiellen postsynaptischen Proteinen3,4,5,6,7.
Die dynamische Variation mit einer CGG-Wiederholungsgröße von >200 wird als vollständige Mutation beschrieben, die die aberrante Hypermethylierung und die anschließende Transkriptionssilencing des FMR1-Promotors 8induziert. Das daraus resultierende Fehlen oder Fehlen des FMRP-Proteins stört die normale neuronale Entwicklung und verursacht FXS9, gekennzeichnet durch verschiedene klinische Symptome, einschließlich mittelschwerer bis schwerer geistiger Behinderung, Entwicklungsverzögerung, hyperaktives Verhalten, schlechte Kontakte und autistische Manifestationen10,11,12. Die Darstellung bei weiblichen FXS-Patienten ist in der Regel milder als bei Männern. Die CGG-Wiederholungsgröße von 55 bis 200 bzw. 45 bis 54 wird als Vormutation bzw. Zwischenstatus klassifiziert. Aufgrund des hohen Grades an Instabilität dehnt sich die CGG-Wiederholungsgröße in einem Vormutations- oder Zwischenallel vermutlich aus, wenn sie von den Eltern auf den Nachwuchs übertragen wird13,14. So sind Träger mit Prämutationsallelen aufgrund der wiederholten Expansion einem hohen Risiko ausgesetzt, Kinder mit FXS zu haben, und in einigen Fällen können Zwischenallele ihre Wiederholungsgröße über zwei Generationen auf den vollen Mutationsbereich ausdehnen15, 16. Darüber hinaus vermitteln Männchen mit Vormutation auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von FX-TAS17,18,19, während Prämutationsweibchen sowohl für FX-TAS als auch FX-POI20prädisponiertsind, 21,22. Kürzlich wurde berichtet, dass autistische Spektrumstörungen mit Entwicklungsverzögerung und Probleme im Sozialen Verhalten bei Kindern mit Vormutation FMR1-Alleles 23,24dargestellt werden.
Um die genaue CGG-Wiederholungsgröße zu bestimmen, ist von großer Bedeutung für die Klassifizierung und Vorhersage der FXS und Fragile X-assoziierten Störungen25,26. Historisch gesehen war die CGG-Repeat-regionsspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Fragmentgrößen- und Südfleckanalyse der Goldstandard für die molekulare Profilierung der FMR1 CGG-Wiederholung27. Herkömmliche spezifische PCR ist jedoch weniger empfindlich gegenüber großen Vormutationen mit mehr als 100 bis 130 Wiederholungen und ist nicht in der Lage, vollständige Mutationen zu verstärken27,28. Darüber hinaus kann die Kapillarelektrophorese auf einem herkömmlichen genetischen Analysator für die Wiederholte Dimensionierung FMR1-PCR-Produkte mit mehr als 200 CGG-Wiederholungen nicht erkennen. Die Southern Blot-Analyse ermöglicht die Differenzierung eines größeren Spektrums von Wiederholungsgrößen, von normalen bis zu vollständigen Mutations-Wiederholungszahlen, und wurde häufig zur Bestätigung vollständiger Mutationen (bei Männern) und zur Differenzierung heterozygoter Allele mit einer vollständigen Mutation von scheinbar homozygote Allele mit normalen Wiederholungsgrößen (bei Weibchen). Die Auflösung für die Quantifizierung der Wiederholungen ist jedoch begrenzt. Noch wichtiger ist, dass diese Schritt-für-Schritt-Teststrategie arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kostenlos ist.
Hier stellen wir eine genaue und robuste PCR-basierte Methode zur Quantifizierung der CGG-Wiederholungen von FMR1vor. Der erste Schritt dieses Tests ist die PCR-Verstärkung der Wiederholungssequenzen im 5’UTR des FMR1-Promotors mit fragilem X PCR-Kit. Die PCR-Produkte werden gereinigt und die Fragmentgröße wird auf einem mikrofluidischen Kapillarelektrophorese-Instrument durchgeführt, und die anschließende Interpretation der Anzahl der CGG-Wiederholungen mit hilfe der Analysesoftware erfolgt, indem Aufschluss über Standards mit bekannten Wiederholungen auf der Grundlage der Begründung, dass die PCR-Fragmentlänge direkt proportional zur Anzahl der CGG-Wiederholungen ist. Das PCR-System enthält Reagenzien, die die Amplifikation des hochGC-reichen Trinukleotid-Repeat-Bereichs erleichtern. Dieser PCR-basierte Assay ist reproduzierbar und in der Lage, alle Bereiche von CGG-Wiederholungen von FMR1-Promotern zu identifizieren. Dies ist eine kostengünstige Methode, die eine breite Anwendung in der molekularen Diagnose und Screening von FXS und Fragile X-bezogenen Störungen mit weniger Umlaufzeit und Investitionen in Ausrüstung finden kann und somit in einem breiteren Spektrum von klinischen Labors.
Protocol
Representative Results
Discussion
FXS ist die zweithäufigste Ursache für geistige Beeinträchtigung nach Trisomie 21, die für fast die Hälfte der X-verknüpften mentalen Retardierung30, die etwa 1 von 4.000 Männern und 1 von 8.000 Frauen betreffen kann. Noch wichtiger ist, fast 1 von 250–1.000 Weibchen tragen eine Vormutation, und diese Häufigkeit ist 1 in 250–1.600 bei Männern26,31,32,33. Da …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Stipendien des NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81860272), des Großen Forschungsplans der Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Grant-Nr. AB16380219), dem China Postdoctoral Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) und der Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
Referências
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