シトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを脆弱なX精神遅滞-1遺伝子で繰り返す堅牢なポリメラーゼ連鎖反応性アッセイ
Summary
脆弱X精神遅滞-1遺伝子で繰り返されるシトシン・グアニン・グアニン・トリヌクレオチドを定量化するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応ベースのアッセイは、脆弱X症候群および脆弱X関連の分子診断およびスクリーニングを容易にするより短いターンアラウンド時間と機器への投資を伴う障害。
Abstract
脆弱X症候群(FXS)および関連疾患は、脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子プロモーターの5’非翻訳領域(UTR)におけるシトシン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返しの拡大によって引き起こされる。従来、遺伝子解析装置上の毛細血管電気泳動断片分析は、FMR1のCGG繰り返しのサイジングに使用されるが、繰り返し数が200を超える場合の正確な測定には追加のサザンブロット分析が必要である。ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱なX PCRキットを用いたFMR1プロモーターの5’UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅であり、続いてマイクロ流体キャピラリー電気泳動器具上のPCR製品およびフラグメントサイジングの精製、分析ソフトウェアを使用して既知の繰り返しを参照して、CGG繰り返しの数の後続の解釈。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、200以上の繰り返し数(完全突然変異として分類)、55から200(変異)、46から54(中間)、および10を含むFMR1プロモーターのCGG繰り返しの全範囲を識別することができる45(通常)。これは、堅牢性と迅速な報告時間を持つFXSおよび脆弱なX関連障害の分類を容易にする費用対効果の高い方法です。
Introduction
脆弱X症候群(FXS)および脆弱X関連疾患、例えば、振戦および運動失調症候群(FX-TAS)、および原発性卵巣不全(FX-POI)は、主にシトシン・グアニン・グアニン(CGG)トリヌクレオチド繰り返し拡張によって引き起こされる5’Xq27.31,2の脆弱X精神遅滞-1(FMR1)遺伝子の領域(UTR)。FMR1エンコードタンパク質(FMRP)は、mRNAの代替スプライシング、安定性、樹状輸送を調節または合成を調節することにより、神経発達およびシナプス可塑性に機能するポリリボソーム関連RNA結合タンパク質である。部分的な後転来タンパク質の3、4、5、6、7.
>200のCGG繰り返しサイズを有する動的変動は、FMR1プロモーター8の異常な過メチル化およびその後の転写サイレンシングを誘発する完全な突然変異として記述される。FMRPタンパク質の欠如または欠乏は、正常な神経発達を破壊し、FXS9を引き起こし、中等度から重度の知的障害、発達遅延、過活動行動を含む様々な臨床症状によって特徴付け、貧しい接触と自閉症の症状10,11,12.女性FXS患者のプレゼンテーションは、一般的に男性のそれよりも穏やかです.55 から 200、45 から 54 までの CGG 繰り返しサイズは、それぞれ前変異および中間ステータスとして分類されます。不安定度が高いため、CGGは、親から子孫13、14に伝染すると、おそらく変異または中間対立遺伝子のサイズを繰り返す。したがって、変異アレエレを有するキャリアは、繰り返し拡大のためにFXSの影響を受ける子供を持つ危険性が高く、場合によっては、中間ア列は、2世代15の完全な突然変異範囲にその繰り返しサイズを拡大することができます。 16.さらに、変異を有する男性はまた、遅発性FX-TAS17、18、19を発症するリスクの増加を伝え、一方、変異女性はFX-TASとFX-POI20の両方に対して素因がある。 21、22。近年、発達遅延や社会行動の問題を伴う自閉症スペクトラム障害が、FMR1アエレメント23,24の変異を有する小児において提示されていると報告されている。
正確なCGG繰り返しサイズを決定することは、FXSおよび脆弱X関連障害25,26の分類および予測に大きな意義がある。歴史的に、フラグメントサイジングとサザンブロット解析を伴うCGGリピート領域特異的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、FMR1 CGGリピート27の分子プロファイリングのゴールドスタンダードとなっています。しかし、従来の特定のPCRは、100から130以上の繰り返しを有する大きな変異に対して感受性が低く、完全な突然変異27、28を増幅することができない。さらに、繰り返しサイジングのための従来の遺伝子アナライザ上の毛細管電気泳動は、200以上のCGG繰り返しを持つFMR1 PCR製品を検出するのに失敗します。サザンブロット解析は、正常から完全な突然変異繰り返し数まで、より広い範囲の繰り返しサイズの区別を可能にし、(男性で)完全な突然変異を確認し、完全な突然変異を持つヘテロ接合性アエレを区別するために広く使用されてきました。明らかに通常の繰り返しサイズを持つホモ接合性のアエレ(雌)。ただし、繰り返しを定量化する解像度は限られています。さらに重要なのは、この段階的なテスト戦略は、労働集約的で時間がかかり、コストがかからないことにあることです。
ここでは、FMR1のCGG繰り返しを定量するための正確で堅牢なPCRベースの方法を提示する。この試験の最初のステップは、脆弱X PCRキットを使用してFMR1プロモーターの5’UTRにおける繰り返し配列のPCR増幅です。PCR製品は精製され、断片サイジングはマイクロ流体毛細血管電気泳動器具上で行われ、その後のCGG反復回数の解釈は、既知の繰り返しに基づく基準を参照して分析ソフトウェアを使用して行う。PCR フラグメントの長さは、CGG の繰り返し回数に直接比例するという根拠。PCRシステムには、高度にGCリッチなトリヌクレオチド反復領域の増幅を促進する試薬が含まれる。このPCRベースのアッセイは再現可能であり、FMR1プロモーターのCGG繰り返しのすべての範囲を識別することができる。これは、FXSおよび脆弱X関連障害の分子診断およびスクリーニングに幅広い応用を見出すことができる費用対効果の高い方法であり、機器への投資の時間と投資を少なくし、より広い範囲の臨床で利用することができる研究 所。
Protocol
Representative Results
Discussion
FXSはトリソミー21に次いで2番目に多い知的障害の原因であり、X連結精神遅滞30の約半分を占めており、男性4,000人に1人、女性8,000人に1人に影響を及ぼす可能性がある。さらに重要なことは、250~1,000人の女性のほぼ1人が変異を持ち、この頻度は男性26、31、32、33の250-1,600の1である。</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、NSFC緊急管理プロジェクト(助成金第81741004号)、中国国家自然科学財団(助成第81860272号)、広西省科学技術財団の主要研究計画(助成)の助成金によって支援されました。グラント・ノーAB16380219、中国ポストドクター科学財団助成金(助成金第2018M630993)、広西自然科学財団(助成金第2018GXNSFAA281067)。
Materials
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
| FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
| FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
| FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
| NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
| Paper towels | |||
| PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
| reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
| S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
| TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |
Referências
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