Cell cykelns specifika mätningar av γH2AX och apoptos efter genotoxisk stress genom flödescytometri
Summary
Den presenterade metoden kombinerar den kvantitativa analysen av DNA dubbel-strand raster (DSBs), cell Cycle distribution och apoptos att möjliggöra cell Cycle-specifik utvärdering av DSB induktion och reparation samt konsekvenserna av reparations fel.
Abstract
Den presenterade metoden eller något modifierade versioner har utformats för att studera specifika behandlingssvar och biverkningar av olika anti-cancerbehandlingar som används i klinisk onkologi. Det möjliggör en kvantitativ och longitudinell analys av DNA-skadesvaret efter genotoxisk stress, som induceras av strålbehandling och en mängd läkemedel mot cancer. Metoden täcker alla stadier av DNA-skadesvaret, vilket ger endpoints för induktion och reparation av DNA dubbel-strand raster (DSBs), cellcykelarrest och celldöd genom apoptos vid reparations fel. Kombinationen av dessa mätningar ger information om cell cykel beroende behandlingseffekter och möjliggör därmed en djupgående studie av samspelet mellan cellulär proliferation och coping mekanismer mot DNA-skador. Eftersom effekten av många cancer Therapeutics inklusive kemoterapeutiska medel och joniserande strålning är begränsad till eller starkt varierar beroende på specifika cell cykel faser, korrelera analyser förlitar sig på en robust och genomförbar metod för att bedöma Behandlingseffekterna på DNA i ett cell cykel-specifikt sätt. Detta är inte möjligt med Single-Endpoint-analyser och en viktig fördel med den presenterade metoden. Metoden är inte begränsad till någon särskild cellinjer och har testats grundligt i en mängd tumör-och normala vävnads celllinjer. Det kan allmänt tillämpas som en omfattande genotoxicitetstest i många områden av onkologi förutom radio-onkologi, inklusive miljö riskfaktor bedömning, Drug screening och utvärdering av genetisk instabilitet i tumörceller.
Introduction
Målet med onkologi är att döda eller att inaktivera cancerceller utan att skada normala celler. Många terapier antingen direkt eller indirekt inducera genotoxisk stress i cancerceller, men också att vissa sträcker sig i normala celler. Kemoterapi eller riktade läkemedel kombineras ofta med strålbehandling för att förbättra radio känsligheten hos den bestrålade tumören1,2,3,4,5, vilket möjliggör en minskning av stråldosen för att minimera normal vävnadsskada.
Joniserande strålning och andra genotoxiska medel inducerar olika typer av DNA-skador, inklusive bas modifikationer, strand tvärlänkar och enkel-eller dubbel Strands raster. DNA dubbel-strand raster (DSBs) är de allvarligaste DNA-lesioner och deras induktion är nyckeln till cell dödande effekt av joniserande strålning och olika cytostatika i radiokemoterapi. DSBs skadar inte bara genomets integritet, utan främjar också bildandet av mutationer6,7. Därför, olika DSB reparations vägar, och mekanismer för att eliminera irreparabelt skadade celler som apoptos har utvecklats under evolutionen. Hela DNA-skadesvaret (DDR) regleras av ett komplext nätverk av signalvägar som når från DNA-skadeigenkänning och cellcykelarrest för att möjliggöra DNA-reparationer, programmerad celldöd eller inaktivering vid reparations fel8.
Den presenterade flödescytometriska metoden har utvecklats för att undersöka DDR efter genotoxisk stress i en omfattande analys som täcker DSB induktion och reparation, samt konsekvenserna av reparations fel. Den kombinerar mätningen av den allmänt tillämpade DSB-markören γH2AX med analys av cellcykeln och induktion av apoptos, med hjälp av klassisk subG1 analys och mer specifik utvärdering av kaspas-3 aktivering.
Kombinationen av dessa endpoints i en analys minskar inte bara tid, arbete och kostnader kostnader, men också möjliggör cell Cycle-specifik mätning av DSB induktion och reparation, samt caspase-3 aktivering. Sådana analyser skulle inte vara möjliga med oberoende genomförda analyser, men de är mycket relevanta för en omfattande förståelse av DNA-skadesvaret efter genotoxisk stress. Många läkemedel mot cancer, såsom cytostatiska föreningar, riktas mot att dela celler och deras effektivitet är starkt beroende av cellcykeln skede. Tillgängligheten av olika DSB reparationsprocesser är också beroende av cellcykeln skede och väg val som är avgörande för reparation noggrannhet, och i sin tur bestämmer ödet för cellen9,10,11, 12. Dessutom, cellcykelspecifik mätning av DSB-nivåer är mer exakt än poolad analys, eftersom DSB-nivåerna är inte bara beroende av dosen av en genotoxisk förening eller strålning, men också på DNA-halten i cellen.
Metoden har använts för att jämföra effekten av olika radioterapier för att övervinna resistensmekanismer i glioblastoma13 och för att dissekera samspelet mellan joniserande strålning och riktade läkemedel i osteosarkom14,15 och atypiska teratoid rabdoid cancer16. Dessutom, den beskrivna metoden har använts i stor utsträckning för att analysera biverkningar av radio-och kemoterapi på mesenkymala stamceller17,18,19,20,21, 22,23,24, som är nödvändiga för reparation av behandling-inducerad normal vävnadsskada och har en potentiell tillämpning i regenerativ medicin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den skisserat metod är lätt till använda och erbjudande en fort, exakt och reproducerbar mättning om DNA skada svaren inklusive dubbel-strand bryta (DSB) induktion och reparera, cell cykel verkningen och apoptotiska cell död. Kombinationen av dessa slutpunkter ger en mer fullständig bild av deras inbördes relationer än enskilda analyser. Metoden kan tillämpas i stor utsträckning som en omfattande genotoxicitetstest inom områdena strålningsbiologi, terapi och skydd, och mer allmänt i onkologi (t. ex. för bed…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Flow Cytometry Facility team på tyska cancer Research Center (DKFZ) för deras stöd.
Materials
| 1000 µL filter tips | Nerbe plus | 07-693-8300 | |
| 100-1000 µL pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 12 x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size | BD Falcon | 352235 | |
| 15 mL tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 200 µL filter tips | Nerbe plus | 07-662-8300 | |
| 20-200 µL pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | Dissolve in water at 200 µg/ml and store aliquots at -20 °C |
| Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011 | BioLegend | 613406 | Dilute 1:20 |
| Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414 | BD Pharmingen | 560626 | Dilute 1:20 |
| BD FACSClean solution | BD Biosciences | 340345 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| BD FACSRinse solution | BD Biosciences | 340346 | For cytometer cleaning routine after measurement |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182 | Dissolve in water to 1x concentration |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin | Biochrom | FG 0415 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.330 | |
| Excel software | Microsoft | ||
| FBS Superior (fetal bovine serum) | Biochrom | S 0615 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| FlowJo v10 software | LLC | online order | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples |
| folded cellulose filters, grade 3hw | NeoLab | 11416 | |
| LSRII or LSRFortessa cytometer | BD Biosciences | ||
| MG132 | Calbiochem | 474787 | optional drug for apoptosis positive control |
| Multifuge 3SR+ | Heraeus | ||
| Paraformaldehyde | AppliChem | A3813 | Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter. |
| Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639 | Cell Signaling Technology | #3475 | Dilute 3:200 |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | 155 016 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
| SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand) | Biomol | AG-40T-0002-C020 | optional drug for apoptosis positive control |
| T25 cell culture flasks | Greiner bio-one | 690160 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| Trypsin/EDTA | PAN Biotech | P10-025500 | Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol |
| U87 MG glioblastoma cells | ATCC | ATCC-HTB-14 | Example cell line used in the protocol |
Referências
- Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
- Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
- Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
- Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
- Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
- Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
- Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
- Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
- Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
- Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
- Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
- Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
- Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
- Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
- Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
- Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
- Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
- Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
- Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
- Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
- Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
- Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
- Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
- Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
- Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).
