Vi presenterar ett protokoll för att använda en proteinmikroarray konstruerad genom att skriva ut influensa antigener på nitrocellulosabaserade diabilder för att samtidigt sond serum för flera antikropp isotyper mot över 250 antigener från olika virusstammar, vilket möjliggör mätning av bredden av serumantikroppar över virus subtyper.
Influensaviruset är fortfarande en betydande orsak till dödlighet i hela världen på grund av den begränsade effekten av tillgängliga vacciner. En viktig utmaning för utvecklingen av universella influensavacciner är hög antigenisk mångfald till följd av antigen drift. Att övervinna denna utmaning kräver nya forskningsverktyg för att mäta bredden av serumantikroppar riktade mot många virusstammar över olika antigena subtyper. Här presenterar vi ett protokoll för att analysera bredden av serumantikroppar mot olika influensavirusstammar med hjälp av ett protein microarray av influensa antigener.
Detta influensa antigen microarray är konstruerad genom att skriva ut renade hemagglutinin och neuraminidastyp antigener på en nitrocellulosa-belagda membran med hjälp av en microarray skrivare. Humana serum inkuberas på mikromatrisen för att binda antikroppar mot influensa antigener. Quantum-dot-konjugerade sekundära antikroppar används för att samtidigt detektera IgG-och IgA-antikroppar som binder till varje antigen på mikromatrisen. Kvantitativ antikroppsbindning mäts som fluorescensintensitet med hjälp av en bärbar Imager. Representativa resultat visas för att påvisa reproducerbarhet i analysen vid mätning av subtypspecifika och Cross-reaktiva influensa antikroppar i humanserum.
Jämfört med traditionella metoder som Elisa, ger influensa antigen microarray en hög genomströmning multiplexade metod som kan testa hundratals serum för flera antikroppar isotyper mot hundratals antigener i en kort tidsram, och därmed har tillämpningar inom seroövervakning och vaccinutveckling. En begränsning är oförmågan att särskilja bindande antikroppar mot neutraliserande antikroppar.
Influensaviruset är ansvarigt för en förlust av 20 000 000 levnadsår årligen genom dödsfall eller funktionshinder, inklusive 1% av alla dödsfall i världen varje år, med oproportionerliga konsekvenser för äldre och populationer i tropikerna och utvecklingsländerna1, 2,3. Förutom sjukdomsbördan för säsongsbetingade epidemier kan uppkomsten av nya influensa stammar via genetiska re-sortiment, antingen naturligt i gemensamma värdar eller artificiellt för bioterrorism, leda till globala pandemier med snabb spridning och hög dödlighet 4 , 5. även om många influensavacciner för närvarande finns tillgängliga begränsas deras effektivitet av subtypspecificitet6, vilket skapar behovet av att utveckla universella influensavacciner som ger långvarig immunitet mot multipla virus stammar7.
En viktig utmaning för utvecklingen av universella influensavacciner är en hög antigenisk mångfald mellan stammar. Den antigena specificiteten hos nuvarande vacciner kombinerat med antigena variationer av cirkulerande virus skapar en obalans mellan vaccinstammar och cirkulerande stammar. Detta ger en evolutionär fördel som gynnar ytterligare genetisk drift bort från vaccinstammar under en epidemi, begränsa Vaccineffekten ofta till mindre än 50%8,9. En ytterligare källa till antigen obalans är äggadaptiva virala mutationer som genereras under vaccin tillverkningen, vilket leder till antikroppar som binder dåligt till cirkulerande virus10,11.
Att övervinna denna utmaning av hög antigen mångfald kommer att kräva nya forskningsverktyg för att karakterisera bredden av redan existerande och framkallade immunsvar över kliniskt relevanta antigena varianter i serum och slemhinnor prover. För närvarande tillgängliga metoder, inklusive hemagglutinering hämning (Hai), mikroneutraliseringstest (MN), och traditionella Elisa, är begränsade till att upptäcka antikroppar mot en enda virusstam i taget, så deras användning för detektion av flera antikroppar isotyper mot flera virusstammar snabbt uttömmer tillgängliga kliniska prov och laboratorieresurser. Dessutom kräver HAI och MN levande virus kultur som endast finns i specialiserade laboratorier.
Proteinmikromatriser, potentiellt bestående av upp till tusentals antigener tryckta på nitrocellulosabaserade diabilder som visas i figur 1, kan fylla detta behov12. Dessa mikromatriser kan produceras och sonderade i en hög genomströmning sätt medan konsumerar små mängder av kliniskt prov för att bestämma kvantitativa antikropp isotyp/subtyp nivåer mot varje enskilt antigen på matrisen. Denna metod för antigen upptäckt har tillämpats på diagnostik och vaccinutveckling mot flera infektiösa patogener13. Hittills har vi producerat proteinmikromatriser för över 35 patogener inklusive över 60 000 totalt uttryckt proteiner och använde dem för att söka över 30 000 mänskliga serum från infekterade och kontrollera individer. En nyligen utvecklad bärbar avbildning plattform för microarray diabilder har gjort denna metod mer tillgänglig för slutanvändaren14.
Bygger på omfattande tidigare arbete av flera bidragsgivare i fält15,16,17,18,19, en influensa protein microarray utvecklades nyligen som innehåller över 250 renade hemagglutinin (ha) antigena varianter med representation av alla 18 subtyper12,20. Med denna metod visades en naturlig influensainfektion för att generera allmänt reaktiva IgG-och IgA-antikroppar mot fylogenetiskt relaterade HA-subtyper, medan en intramuskulär influensavaccination endast genererade subtypspecifika IgG antikroppar21. Emellertid, lägga till ett adjuvans som aktiverar Toll-liknande receptorer till influensa vaccin visades att bredda den framkallade IgG antikropp svar över HA subtyper i djurstudier22.
Denna microarray används för närvarande för att avsöka serum som samlats in från en prospektiv kohortstudie av högskolestudenter som följdes för influensainfektion. Här rapporteras metoden för mikromatrisen för influensa antigen med demonstration av analys reproducerbarhet för att påvisa subtypspecifika och tvär reaktiva antikroppar i en delmängd av prover från denna studie.
Den influensa antigen microarray protokoll som beskrivs här är anpassningsbar till alla projekt som kräver att analysera antikroppssvar på många antigener. Den microarray plattform kan användas med någon önskad uppsättning av protein antigener uttryckt i alla system som kan uppnå 0,1 mg/mL eller högre avkastning med eller utan rening som tidigare beskrivits12. Om icke-renat protein antigen (t. ex. uttryckt i in vitro-transkription och översättningssystem) används direkt för att skriva ut mikromatriser, bör komponenterna i protein uttrycks systemet (t. ex. e. coli lysate) tillsättas 1:10 till blockeringsbuffert som används för spädning av serum och antikroppar för kvalitetskontroll för att blockera alla antikroppar riktade mot dessa komponenter. Bildkonfigurationer är tillgängliga med ett lägre antal större kuddar på varje bild för att rymma ett högre antal antigener per matris. För denna studie använde vi en GeneMachines OmniGrid 100 microarray skrivare som utnyttjar stift som direkt kontakt med nitrocellulosa yta att deponera fläckar på matrisen. Även om denna microarray-skrivare inte längre är kommersiellt tillgänglig, kan andra kommersiellt tillgängliga microarray-skrivare användas i detta protokoll men kan kräva anpassade Pins (antingen kontakt eller icke-kontakt) och programvara och bör ha tillräcklig plats upplösning och kompatibilitet med bilder och Imager. Beroende på reaktivitet av serum kan spädningar från 1:50 till 1:400 användas. Serum fri buffert kan användas som en negativ kontroll, medan monoklonala antikroppar som är kända för att binda till antigen kan användas som en positiv kontroll.
Användarna bör vara medvetna om några felsökningsproblem. Syftet med kvalitetskontroll kontrollen med hjälp av antikroppar mot hans tagg är att kontrollera om det finns några antigener för vilka utskriften inte lyckades. Alla fläckar som konsekvent ger låg signal i kvalitetskontroll kontrollera av flera matriser sannolikt representerar otillräcklig antigen tryckt. Möjliga orsaker är aggregering eller nederbörd eller antigen i käll plattan eller dålig kontakt mellan tryckning stift och microarray glida på grund av varierande tjocklek av nitrocellulosa pad. Vid denna punkt, vi utför inte analys normalisering baserat på kvantitativa resultat av kvalitetskontroll kontrollen, med tanke på att den upptäckta bindningen av anti-his antikroppar kan påverkas av tillgängligheten av denna tagg, som beror på den 3-dimensionella konformation specifika för varje antigen.
Mikromatrisen för influensa antigen ger flera fördelar jämfört med traditionella metoder som ELISA och kompletterar funktionella analyser som HAI och MN. Den 16-pad proteinet microarray är en prov-sparing teknik med kapacitet att mäta antikroppar av flera isotyper samtidigt mot cirka 300 antigener från 1 μL serum. Antalet antigener kan ökas till tusentals genom att minska antalet kuddar per diabilder. Multiplexade assay också reservdelar personal tid och förbrukningsmaterial resurser, med tanke på att hundratals serum kan sonderade för antikroppar i 2 dagar, och alla andra material än diabilder och reagenser är återanvändbara så inte genererar stora mängder plastavfall.
Även om microarray-skrivare inte kan distribueras i stor utsträckning, kan microarray-bilder skrivas ut på en central plats och sedan transporteras till slutanvändaren för att sondera. Den enda utrustning som krävs för avsökning är låg kostnad och bärbar Imager. Målet med att sprida detta protokoll är att göra utnyttjandet av denna teknik mer utbredd.
De viktigaste begränsningarna för influensa antigen microarray är oförmågan att karakterisera funktionen och kinetiken hos de upptäckta antikropparna. Microarrayen detekterar en polyklonala uppsättning bindande antikroppar för varje antigen. Dessa antikroppar kan eller inte kan vara funktionella i neutraliserande virus i HAI och MN analyser. Men, HAI och MN analyser kräver levande virus kultur med tillhörande behov av specialiserade anläggningar med hög nivå biosäkerhet skåp för att testa för antikroppar mot aviär subtyper av influensa, medan proteinet microarray inte innebär levande virus komponenter så kan utnyttjas i alla grundläggande laboratorium. När det gäller bindningskinetik ger en enda utspädning av serumprobed med en matris som innehåller en enda koncentration av varje antigen en enda datapunkt, som representerar en sammansatt mängd och tillhörighet som summerats över alla antikroppar som binder till antigenet . För att fullt ut lösa antigener-antikroppsbindningskinetik krävs multipla antigen koncentrationer och/eller seriella utspädningar av serum.
Trots dessa begränsningar, är influensa antigen microarray ett användbart verktyg för att karakterisera bredden av influensa antikroppar över det antigena landskapet som kan komplettera funktionella analyser som är mer begränsade i dataflöde och tillgänglighet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja erkänna prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) för att samla in Human sera under University of Maryland IRB protokoll #313842 finansieras av DARPA N66001-18-2-4015 P00001. Författarna skulle också vilja erkänna prof. Florian Krammer (Icahn School of Medicine, MT. Sinai, NY, USA) för att tillhandahålla trimerized HA och NA antigener finansieras av ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan stöds delvis av National Center for Research Resources och National Center for framryckande translationella vetenskaper, National Institutes of Health, genom Grant KL2 TR001416. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på NIH.
16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |