גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס
Summary
מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.
Abstract
הגדרת מנגנוני הסלולר שבבסיס המחלה חיונית לפיתוח therapeutics הרומן. אסטרטגיה המשמשת לעתים קרובות לפענח מנגנונים אלה היא להחדיר מוטציות בגנים המועמדים ולתאר באופן איכותי שינויים במבנה של רקמות ומרקלים סלולריים. עם זאת, תיאורים איכותניים לא יכולים ללכוד הבדלים עדינים, אולי באופן שונה וריאציות פנויואיות על פני אנשים באוכלוסיה, והם מוערך לעתים קרובות סובייקטיבי. כאן, גישות כמותיים מתוארות כדי ללמוד את המבנה של רקמות ואורגלים באלאואודה caenorditis באמצעות סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בשילוב עם תוכנות ביולוגיות זמינות מסחרית עיבוד. ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים על שלמות הסינפסה (גודל ורמות זריחה משולבת), פיתוח שרירים (גודל תא השריר ואורך הפילמנט רירן), ומורפולוגיה מיטוכונדריאלי (מעגליות וגודל) בוצעה כדי להבין ההשפעות של מוטציות גנטיות על אלה מבנים סלולריים. גישות כמותיים אלה אינן מוגבלות ליישומים המתוארים כאן, שכן ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את המבנה של רקמות אחרות ואורגלות בתוך הנימטודה, כמו גם באורגניזמים אחרים במודל.
Introduction
האלמטדה (האלאים) מנוצל יותר ויותר כמערכת מודל לחשיפת התהליכים הביולוגיים והמולקולריים המעורבים במחלות אנושיות. נמטודות מבוגר יש אורך הגוף של רק מעל 1 מ”מ, והוא יכול לייצר דגירה גדולה של עד 300 ביצים1. לאחר בקיעה, הג דורשים רק 3-4 ימים כדי להגיע לבגרות, ולחיות במשך כ 2-3 שבועות2. בשל קלות התפירה, הג הוא אחד המבוקשים ביותר בדגמי בעלי חיים vivo לביצוע הקרנת סמים מהירה וחסכונית כדי לזהות therapeutics למחלות אנושיות. בנוסף, שימור גנטי שלה, הגדרה התנהגות היטב, גוף שקוף עבור מיקרוסקופ אור פלואורסצנטית או קל, וקלות של מניפולציה גנטית להפוך את המחקר של ההשלכות הסלולר והמולקולריים של מוטציות גנטיות בקלות achieveable 3. הגנום C. אלגיה מניות כ 60-80% האורתולוגיה עם הגנים האנושיים, וכ-40% מהגנים האלה ידועים כקשורים למחלות. כמה מחלות אנושיות שהיו מדגם ולמדו בג כוללים הפרעות ניווניות (מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת amyotrophic לרוחב, charcot-מארי-שיניים מחלות), מחלות הקשורות שרירים ( ניוון שרירים duchenne), ומחלות מטבולית (היפרגליקמיה)2,4. ברוב ההפרעות האנושיות, התאמה לוקליזציה תאית וארגונית מחלות ושינויים מורפולוגיים מתרחשים, אשר ניתן בקלות להעריך במודל נמטודות.
סמנים פלורסנט השתמשו באופן נרחב כדי לתייג רקמות ואורגלים להדמיה דינמית מתחת למיקרוסקופ. עם זאת, ב -C. אלגיה, שיטות קונבנציונליות להערכת אי סדירות מורפולוגית בשל מוטציות גנטיות הסתמך במידה רבה על תיאורים חזותיים. בעוד ההערכות האיכותניות יכולות לכסות טווחים רחבים יותר של תיאורים פנותטיים (מורפולוגיה סינפטית, מקלפת מערכות ה-GFP, צורה מסוימת של האקסון, עובי סיבי השריר, וכו ‘) ולספק את ההשקפה של עין הציפור של שינויים מורפולוגיים, הם פחות מתאימים השוואת וריאציות קטנות בין קבוצות שונות. יתרה מזאת, הערכות איכותניות מבוססות על הערכה חזותית וסובייקטיבית, שעלולה להוביל לחריגה או מתחת להערכות של חריגות מורפולוגיות. לבסוף, תצפיות איכותניות יכולות גם להשתנות במידה רבה בין אנשים, יצירת קשיים עם שכפול נתונים.
בשנים האחרונות, מספר אלגוריתמים ידידותיים למשתמש, הזמינים בקלות, שיכולים לנתח את התמונות באמצעות כימות. עם זאת, הניצול של תוכנה כגון ניתוח תמונה עבור כמה מחקרים מורפולוגיים, במיוחד ביחס שרירי קיר הגוף והמיטוסים, ב C. מחקרים המחקר הפכה מאחור. כדי לשפר את הניתוח המבני הבסיסיים ב -C. אלגיה, חלק מתוכנת ניתוח התמונה הפתוחה, הקוד הפתוח, היתה שבירה להשוות את ההשפעות של מוטציות גנטיות על המיטו, שריר קיר הגוף וסינפטית ורפולוגיה. אלה הליכים ניסיוניים לתאר בפרוטרוט כיצד תוכניות אלה (פיג’י, אילאסטיק, cellprofiler, squassh) ניתן להשתמש כדי להעריך את השינויים בגודל סינפטית ולוקליזציה של חלבון סינפטית, שריר קיר הגוף באזור ואורך סיבים, וגודל מיטוכונדריאלי ו מעגליות כתוצאה של מוטציות גנטיות ב nematode.
Protocol
Representative Results
Discussion
וריאציות מורפולוגית העריכו לעתים קרובות באמצעות ספירה ידנית של הבדלים מורגש או שימוש בספי שרירותי כדי לקבוע פגמים בהשוואה לסוג פראי הפנוטיפים. לאחרונה, עם זאת, שיטות כמותיים שימשו למחקרים השוואתיים של המבנה כדי למדוד במדויק ולתאר שינויים ברמה התאית התאית בצורה לא משוחדת. היכולת לזהות הב?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת נוימן עבור דיונים וקלט יקרי ערך. זנים מסוימים סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחברים מודים WormBase על שפע של מידע על C. אלגיה, ולהכיר מונש מיקרו הדמיה, אוניברסיטת מונש, לאספקת מכשור, הדרכה ותמיכה טכנית. עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר CMTAA (2015 ו 2018), ו-NHMRC פרויקט מענקים 1101974 ו 1099690 הוענק B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
Referências
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. , (1974).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer’s disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
- Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
- Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
- Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
- Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
- Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
- Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
- Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
- Teoh, J. -. S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
- Bird, T. D. . Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , (1998).
- Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
- Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
- Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
- Zhu, P. -. P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
- Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
- Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
- Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).
