Caenorhabditis elegans में सेलुलर संरचनाएं और Organelle Morphology के अध्ययन के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण
Summary
इस अध्ययन synaptic आकार और स्थानीयकरण की मात्रात्मक माप की रूपरेखा, मांसपेशियों की आकृति विज्ञान, और सी elegans में mitochondrial आकार स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि प्रसंस्करण उपकरण का उपयोग कर. इस दृष्टिकोण सी elegans में भविष्य के अध्ययन की अनुमति देता है मात्रात्मक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का एक परिणाम के रूप में ऊतक और organelle संरचनात्मक परिवर्तन की सीमा की तुलना करें.
Abstract
सेलुलर तंत्र अंतर्निहित रोग परिभाषित उपन्यास चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. एक रणनीति अक्सर इन तंत्र को जानने के लिए इस्तेमाल किया उम्मीदवार जीन में उत्परिवर्तन परिचय और गुणात्मक ऊतकों और सेलुलर organelles की आकृति विज्ञान में परिवर्तन का वर्णन है. हालांकि, गुणात्मक विवरण सूक्ष्म phenotypic मतभेद पर कब्जा नहीं हो सकता है, एक जनसंख्या में व्यक्तियों में phenotypic विविधताओं गलत बयानी हो सकता है, और अक्सर व्यक्तिपरक मूल्यांकन कर रहे हैं. यहाँ, मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जैव छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans में ऊतकों और organelles की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए वर्णित हैं. synapse अखंडता (आकार और एकीकृत फ्लोरोसेंट के स्तर), मांसपेशियों के विकास (मांसपेशी कोशिका आकार और मायोसिन फिलामेंट लंबाई) को प्रभावित करने वाले फीनोटाइप का एक मात्रात्मक विश्लेषण, और माइटोकोंड्रियाल आकारिकी (सर्कुलरिटी और आकार) को समझने के लिए किया गया था इन सेलुलर संरचनाओं पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव. ये मात्रात्मक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित अनुप्रयोगों तक ही सीमित नहीं हैं, क्योंकि वे आसानी से सूत्रकृमि में अन्य ऊतकों और organelles की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अन्य मॉडल जीवों में.
Introduction
सूत्रकृमि कैनोरहैब्डिस एलिगेन्स (सी एलिगन) का उपयोग मानव रोग में शामिल जैविक और आणविक प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में तेजी से किया जाता है। एक वयस्क सूत्रकृमि की शरीर की लंबाई केवल 1 मिमी से अधिक होती है और यह 300 अंडे1तक का एक बड़ा अंड उत्पन्न कर सकता है। अंडे से निकलने के बाद, सी elegans केवल वयस्कता तक पहुँचने के लिए 3-4 दिनों की आवश्यकता होती है, और लगभग 2 से 3 सप्ताह2के लिए रहते हैं। culturing की अपनी आसानी के कारण, सी elegans वर्तमान में मानव रोगों के लिए चिकित्सा की पहचान करने के लिए लागत प्रभावी, तेजी से दवा स्क्रीनिंग के संचालन के लिए vivo पशु मॉडल में सबसे अधिक मांग के बाद में से एक है. इसके अतिरिक्त, इसके आनुवंशिक संरक्षण, अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार प्रतिमान, फ्लोरोसेंट या प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए पारदर्शी शरीर, और आनुवंशिक हेरफेर की आसानी सेलुलर और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के आणविक परिणामों का अध्ययन आसानी से प्राप्त करने योग्य 3. सी एलिगन जीनोम मानव जीनों के साथ लगभग 60-80% ऑर्थोलॉजी का हिस्सा है, और उन जीनों में से लगभग 40% रोग से संबंधित माने जाते हैं। मानव रोगों में से कुछ है कि मॉडलिंग की गई है और सी elegans में अध्ययन किया गया है neurodegenerative विकार (अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, amyotrophic पार्श्व स्क्लेरोसिस, Charcot-मैरी-टूथ रोग), मांसपेशियों से जुड़े रोगों में शामिल हैं ( Duchenne मांसपेशियों dystrophy), और चयापचय रोगों (hyperglycemia)2,4. अधिकांश मानव विकारों में, रोग-प्रेरित सेलुलर और ऑर्गेनेल स्थानीयकरण और आकृतिक परिवर्तन होते हैं, जिन्हें आसानी से सूत्रकृमि मॉडल में मूल्यांकन किया जा सकता है।
फ्लोरोसेंट मार्कर ों का उपयोग सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत गतिशील दृश्य के लिए ऊतकों और आर्गेनाले को लेबल करने के लिए व्यापक रूप से किया गया है। हालांकि, सी elegansमें, पारंपरिक तरीकों कि आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण आकृतिक अनियमितताओं का आकलन काफी हद तक दृश्य विवरण पर भरोसा किया है. जबकि गुणात्मक आकलन phenotypic विवरण की व्यापक श्रेणियों को कवर कर सकते हैं (synaptic आकारिकी, GFP clumping, विशिष्ट axonal आकार, मांसपेशी फाइबर मोटाई, आदि) और रूपात्मक परिवर्तन के एक पक्षी की आंख दृश्य प्रदान करते हैं, वे कम अच्छी तरह से अनुकूल हैं के लिए विभिन्न समूहों में छोटी विविधताओं की तुलना करना. इसके अलावा, गुणात्मक मूल्यांकन दृश्य, व्यक्तिपरक मूल्यांकन पर आधारित होते हैं, जिससे रूपात्मक असामान्यताओं के अधिक या कम-अनुमान हो सकते हैं। अंत में, गुणात्मक टिप्पणियों भी व्यक्तियों के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं, डेटा प्रतिकृति के साथ कठिनाइयों का निर्माण.
हाल के वर्षों में, उपयोगकर्ता के अनुकूल, आसानी से उपलब्ध कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम है कि मात्रात्मक विश्लेषण छवियों का विश्लेषण कर सकते हैं की एक संख्या विकसित किया गया है. हालांकि, कुछ आकृतिक अध्ययन के लिए इस तरह के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग, विशेष रूप से शरीर की दीवार की मांसपेशियों और mitochondria के संबंध में, सी elegans अनुसंधान में पीछे lagged है. सी elegansमें अंतर्निहित संरचनात्मक विश्लेषण में सुधार करने के लिए, आसानी से उपलब्ध में से कुछ, खुला स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर मात्रात्मक मांसपेशियों mitochondria पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव की तुलना करने के लिए परीक्षण किया गया, शरीर की दीवार की मांसपेशियों और synaptic Morphology. इन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विस्तार से रूपरेखा कैसे इन कार्यक्रमों (फिजी, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) synaptic आकार और synaptic प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शरीर की दीवार मांसपेशी क्षेत्र और फाइबर लंबाई, और mitochondrial आकार और सूत्रकृमि में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के परिणामस्वरूप वृत्ताकारता।
Protocol
Representative Results
Discussion
Morphological विविधताओं अक्सर ध्यान देने योग्य मतभेद ों की मैनुअल गिनती या मनमाने ढंग से सीमा का उपयोग करने के लिए एक जंगली प्रकार phenotype की तुलना में दोष निर्धारित करने के माध्यम से मूल्यांकन किया गया है. हाल ही म?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मूल्यवान विचार विमर्श और इनपुट के लिए न्यूमन प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. कुछ उपभेदों सीजीसी, जो अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान की गई. लेखक सी elegansपर जानकारी के अपने धन के लिए WormBase धन्यवाद, और साधना, प्रशिक्षण और तकनीकी सहायता के प्रावधान के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग, मोनाश विश्वविद्यालय, स्वीकार करते हैं। इस कार्य को सीएमटीए अनुसंधान अनुदान (2015 और 2018) द्वारा समर्थित किया गया था, और एनएचएमआरसी परियोजना अनुदान 1101974 और 1099690 को बी.एन.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
Referências
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