Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans
Summary
Questo studio descrive le misurazioni quantitative delle dimensioni sinaptiche e della localizzazione, della morfologia muscolare e della forma mitocondriale in C. elegans utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini liberamente disponibili. Questo approccio consente a studi futuri in C. elegans di confrontare quantitativamente l’estensione dei cambiamenti strutturali dei tessuti e degli organelli a seguito di mutazioni genetiche.
Abstract
La definizione dei meccanismi cellulari alla base della malattia è essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Una strategia frequentemente utilizzata per svelare questi meccanismi consiste nell’introdurre mutazioni nei geni candidati e descrivere qualitativamente i cambiamenti nella morfologia dei tessuti e degli organelli cellulari. Tuttavia, le descrizioni qualitative potrebbero non cogliere le sottili differenze fenotipiche, potrebbero travisare le variazioni fenotipiche tra gli individui in una popolazione e sono spesso valutate soggettivamente. Qui, gli approcci quantitativi sono descritti per studiare la morfologia dei tessuti e degli organelli nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia confocale a scansione laser combinata con un software di elaborazione bio-immagine disponibile in commercio. È stata eseguita un’analisi quantitativa dei fenotipi che influenzano l’integrità delle sinapsi (livelli di dimensioni e fluorescenza integrata), lo sviluppo muscolare (dimensioni delle cellule muscolari e la lunghezza del filamento della miosina) e la morfologia mitocondriale (circolarità e dimensione) per comprendere gli effetti delle mutazioni genetiche su queste strutture cellulari. Questi approcci quantitativi non si limitano alle applicazioni qui descritte, in quanto potrebbero essere facilmente utilizzati per valutare quantitativamente la morfologia di altri tessuti e organelli nel nematode, così come in altri organismi modello.
Introduction
Il nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) è sempre più utilizzato come sistema modello per scoprire i processi biologici e molecolari coinvolti nella malattia umana. Un nematode adulto ha una lunghezza del corpo di poco superiore a 1 mm e può produrre una grande covata fino a 300 uova1. Dopo la schiusa, C. elegans richiedono solo 3-4 giorni per raggiungere l’età adulta, e vivere per circa 2 o 3 settimane2. Grazie alla sua facilità di coltura, C. elegans è attualmente uno dei modelli animali in vivo più ricercati per condurre uno screening rapido e conveniente dei farmaci per identificare le terapie per le malattie umane. Inoltre, la sua conservazione genetica, paradigmi comportamentali ben definiti, corpo trasparente per la fluorescenza o microscopia luminosa, e la facilità di manipolazione genetica rendono lo studio delle conseguenze cellulari e molecolari delle mutazioni genetiche facilmente raggiungibili 3. Il genoma di C. elegans condivide circa il 60-80% dell’ortologica con i geni umani, e circa il 40% di questi geni sono noti per essere correlati alla malattia. Alcune delle malattie umane che sono state modellate e studiate in C. elegans includono disturbi neurodegenerativi (malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth), malattie associate ai muscoli ( Distrofia muscolare di Duchenne) e malattie metaboliche (iperglicemia)2,4. Nella maggior parte dei disturbi umani, si verificano la localizzazione cellulare e di organello indotta dalla malattia e cambiamenti morfologici, che possono essere facilmente valutati nel modello nematode.
I marcatori fluorescenti sono stati ampiamente utilizzati per etichettare tessuti e organelli per la visualizzazione dinamica al microscopio. Tuttavia, in C. elegans, i metodi convenzionali che valutano le irregolarità morfologiche dovute a mutazioni genetiche si sono in gran parte affidati a descrizioni visive. Mentre le valutazioni qualitative possono coprire più ampie gamme di descrizioni fenotipiche (morfologia sinaptica, gAPPamento GFP, forma assonale specifica, spessore della fibra muscolare, ecc.) e forniscono una visione a ciglio dell’uccello dei cambiamenti morfologici, sono meno adatti per confrontando piccole variazioni tra gruppi diversi. Inoltre, le valutazioni qualitative si basano su valutazioni visive soggettive, che possono portare a sovra o sottosoprastime di anomalie morfologiche. Infine, le osservazioni qualitative possono anche variare notevolmente da individuo a individuo, creando difficoltà con la replica dei dati.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di algoritmi computazionali facili da usare e facilmente reperibili che possono analizzare quantitativamente le immagini. Tuttavia, l’utilizzo di tale software di analisi delle immagini per alcuni studi morfologici, soprattutto in relazione ai muscoli della parete del corpo e ai mitocondri, nella ricerca di C. elegans è rimasto indietro. Per migliorare l’analisi strutturale sottostante in C. elegans, alcuni dei software di analisi delle immagini open source prontamente disponibili sono stati sperimentati per confrontare quantitativamente gli effetti delle mutazioni genetiche sui mitocondri muscolari, sul muscolo della parete del corpo e sulla sinaptica morfologia. Queste procedure sperimentali delineano in dettaglio come questi programmi (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) possono essere utilizzati per valutare i cambiamenti nella dimensione sinaptica e nella localizzazione delle proteine sinaptiche, dell’area muscolare della parete del corpo e della lunghezza della fibra e delle dimensioni mitocondriali e circolarità a seguito di mutazioni genetiche nel nematode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le variazioni morfologiche sono state frequentemente valutate attraverso il conteggio manuale di differenze evidenti o utilizzando soglie arbitrarie per determinare i difetti rispetto a un fenotipo di tipo selvaggio. Più recentemente, tuttavia, sono stati utilizzati metodi quantitativi per studi comparativi di morfologia per misurare e descrivere con precisione i cambiamenti a livello cellulare e subcellulare in modo imparziale. La capacità di identificare differenze sottili ma biologicamente rilevanti tra i fenotipi ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Neumann per preziose discussioni e contributi. Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Gli autori ringraziano WormBase per la sua ricchezza di informazioni su C. eleganse riconoscono Monash Micro Imaging, Monash University, per la fornitura di strumentazione, formazione e supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca CMTAA (2015 e 2018), e NHMRC Project Grants 1101974 e 1099690 assegnato a B.N.
Materials
| Agar-agar | Merck | 1.01614.1000 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP8 | Inverted platform |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss AG | Zeiss Axio Imager M2 | |
| Glass coverslips #1 | Thermo scientifique | MENCS22221GP | |
| Glass coverslips #1.5 | Zeiss | 474030-9000-000 | Made by SCHOTT |
| Glass slides | Thermo scientifique | MENS41104A/40 | |
| Light LED | Schott | KL 300 LED | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tryptone (Peptone from casein) | Merck | 107213 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Yeast Extract | Merck | 103753 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium |
| Peptone (Peptone from meat) | Merck | 107214 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Agar | Sigma | A1296 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Calcium chloride | Merck | 102382 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Dipotassium phosphate | Merck | 105101 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar |
| Disodium phosphate | Merck | 106586 | Ingredients for M9 buffer |
| Sodium chloride | Merck | 106404 | Ingredients for M9 buffer |
| Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 104873 | Ingredients for M9 buffer |
| Magnesium sulfate | Merck | 105886 | Ingredients for M9 buffer |
| Pasteur pipette | Corning | CLS7095D5X-200EA | |
| Petri dishes | Corning | CLS430589-500EA | |
| Platinum wire | Sigma | 267201-2G | |
| Spatula | Met-app | 2616 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma | L9756-5G |
Referências
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